二球悬铃木LFY及MADS-box同源基因克隆、功能验证及其系统进化研究

论文摘要

二球悬铃木是城市绿化中最重要的园林树种之一。因其生长迅速、冠大荫浓、适应性广、抗逆性强、耐修剪、且具有较强的抗污染和净化空气的能力,被誉为“行道树之王”,在我国黄河流域、长江流域地区以及全球温带及亚热带各大城市,被广泛用作公路、街道、庭院和工厂绿化树种。然而,悬铃木在春夏之交“落果飞毛”的问题严重影响了人们的正常生活与身心健康,近些年来,不少科研工作者围绕这一问题进行了广泛的研究,但最终未能从根本上解决问题。本项研究的主要目标是培育雌性/雄性或者雌雄性均不育的悬铃木。为此,首先用GUS报告基因优化并建立根癌农杆菌介导悬铃木的遗传转化体系,构建了悬铃木雌花cDNA文库,为后期通过基因工程的手段获得不育的悬铃木奠定了坚实的基础;此外,通过RACE技术克隆了悬铃木LFY、SOC1及A-,B-,C-,E-类MADS-box同源基因,为通过干涉或者克隆花发育特异启动子结合Barnase毒素基因诱导“无球果”悬铃木提供了可能,并对相关基因进行了表达分析和功能验证。主要的研究结果如下:1.用GUS报告基因建立根癌农杆菌介导悬铃木的遗传转化体系,选择叶长约2cm左右、叶龄为40d的无菌苗叶片,用0.4M的甘露醇预处理6h,使用OD值为0.6-0.8的菌液,浸染8-10min,共培养5d,经过恢复培养、选择培养,从312个外植体中共获得抗性苗12株,其中PCR阳性和Southern杂交阳性植株分别为8株和5株,转化率为1.58%;2.针对悬铃木组织中多酚物质含量较高的特点,比较了CTAB-LiCl法、改进SDS/酚法、Trizol Kit法和异硫氰酸胍法四种不同的方法提取悬铃木组织总RNA,其中改进的CTAB法提取的悬铃木总RNA的18S和28S RNA带型清晰可辨,紫外分光光度记检测OD260/OD280在1.9-2.0之间,证明抽提的RNA质量好、纯度高,适合后续的分子生物学要求,构建了一个跟花发育相关的cDNA文库。原始文库和扩增文库滴度分别为5.3×106和8×109pfu/mL,文库重组率为97%,随机挑选100个单克隆测序,87%的单克隆为全长;3.通过RACE技术得到了LFY、FUL、AP3、SEP1、SEP3同源基因的全长cDNA和AG、SOC1的3’端,获得的7个基因分别命名为PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaSEP1、PaSEP3、PaAG和PaSOC1。其中PaLFYcDNA全长为1419bp,包含1122bp的完整ORF,编码一个具有374个氨基酸的蛋白质,5’/3’-UTR分别为54 bp和213bp;PaFULcDNA全长为996bp,包含735bp的完整ORF,编码一个具有245个氨基酸的蛋白质,5’/3’-UTR分别为128和103bp;PaAP3 cDNA全长为930bp,包含678bp的完整ORF,编码一个具有226个氨基酸的蛋白质,5’/3’-UTR分别为83和139bp;PaSEP1cDNA全长为1160bp,包含735bp的完整ORF,编码一个具有245个氨基酸的蛋白质5’/3’-UTR分别为163和251bp;PaSEP3 cDNA全长为993bp,包含720bp的完整ORF,编码一个具有240个氨基酸的蛋白质,5’/3’-UTR分别为64和179bp;PaAG基因cDNA 3’端长为838bp,包含一个570 bp的不完整的开放阅读框架,编码190个氨基酸,3’端有243 bp长的非翻译区;PaSOC1基因cDNA 3’端为638bp,包含一个546 bp的不完整的开放阅读框架,编码182个氨基酸。3′端有82 bp长的非翻译区;4.通过RT-PCR和实时定量PCR对PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaAG、PaSEP1、PaSEP3、PaSOC1同源基因进行了表达分析;5.构建了PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaSEP1、PaSEP3五个基因的正义（超量）植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得烟草转基因植株,nptⅡ和目的基因的PCR阳性率在85%以上;6.采用最大似然法（maximum-likehood,ML）、贝叶斯法（Mrbeyes）和邻接树法（neighbor-joining,NJ）对所得悬铃木花发育相关基因及其同源基因的核苷酸或蛋白质序列保守的MIK或者MIKC结构域进行了进化分析,构建ML、Mrbeyes和NJ树,确定悬铃木的系统进化地位,表明悬铃木为基本的真双子叶植物,跟山龙眼目的山龙眼科和莲科、黄杨目、昆兰树目、毛茛目和青风藤科进化地位较近,属于较为原始的物种。7.采用分支模型、位点模型和分支位点模型对悬铃木PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaSEP1、PaSEP3编码区进行了选择压力分析。分支模型和位点模型中,均没有检测到正选择位点存在。在分支一位点模型A中,分支PaAG、PaSEP1检测出该位点在前景分支中处于正选择下（ω2=26.17和277.12）,也具极显著性（P＜0.01）,表明是由于正选择压力而形成的。8.以拟南芥作为参照（120MYA,110-130MYA）,用5个与拟南芥A-,B-,C-,E-类MADS-box基因最为同源的基因形成的联合基因数据来构建分子生物钟,发现悬铃木是在134.6MYA（123.4-145.8MYA）浮现的,与拟南芥相比,跟进化上较原始的禾本目水稻及胡椒目鱼腥草更为接近（137.1 MYA,125.7-148.5MYA）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 国内外悬铃木研究现状
• 1.3 悬铃木的花发育过程及其研究意义
• 1.3.1 悬铃木花发育的过程
• 1.3.2 悬铃木花发育研究的分子生物学意义
• 1.4 植物花的形成与发育
• 1.4.1 开花诱导（Floral initiation）
• 1.4.2 花分生组织决定（Floral meristem identity）
• 1.4.3 花器官发育（Floral organ development）
• 1.4.4 花发育基因的调控网络
• 1.5 花发育相关基因在植物性状改良中的应用
• 1.5.1 开花时间的调节
• 1.5.2 花型的改变
• 1.5.3 创造不育植株
• 1.6 本课题的研究目的与意义
• 第二章 农杆菌介导的悬铃木遗传转化体系的优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 转化受体材料
• 2.2.2 转化载体及培养方法
• 2.2.3 悬铃木的遗传转化方法
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 头孢霉素和Timentin抑菌效果比较
• 2.4.2 转化效率
• 2.5 讨论
• 第三章 悬铃木雌花噬菌体cDNA文库的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 试验材料与处理
• 3.2.2 RNA提取所用试剂
• 3.2.3 其它主要试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 RNA的提取、纯化及mRNA分离
• 3.3.2 cDNA合成
• 3.3.3 cDNA与载体连接
• 3.3.4 体外包装、效价测定与文库扩增
• 3.3.5 测序和数据分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 总RNA抽提及mRNA分离
• 3.4.2 双链cDNA合成
• 3.4.3 文库质量检测
• 3.5 讨论
• 3.5.1 RNA提取
• 3.5.2 文库构建
• 第四章 悬铃木花发育相关基因的克隆及表达分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株和载体
• 4.2.3 主要分子生物学试剂
• 4.3 方法
• 4.3.1 RACEs
• 4.3.2 扩增产物克隆及序列测定
• 4.3.3 RT-PCR克隆悬铃木看家基因actin
• 4.3.4 全长cDNA序列分析
• 4.3.5 基因组织/器官异性表达分析
• 4.3.6 RT-PCR分析七个花发育相关基因的表达
• 4.3.7 两步法定量RT-PCR分析基因表达水平（Real-time PCR）
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 悬铃木看家基因Actin的克隆
• 4.4.2 悬铃木花发育相关基因的克隆
• 4.4.3 悬铃木花发育特异基因的表达分析
• 4.5 讨论
• 第五章 悬铃木花发育特异基因的功能验证
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 转化受体材料
• 5.2.2 菌株和载体
• 5.3 方法
• 5.3.1 Sense植物表达载体的构建
• 5.3.2 转化烟草分析基因的异源表达
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 植物正义（超量）表达遗传转化载体的构建
• 5.4.2 转基因烟草植株的分子分析
• 5.4.3 转基因烟草开花时间及花型分析
• 第六章 悬铃木遗传进化地位研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 AP1/SQUA-like亚家族
• 6.3.2 AP3/PI-like（DEF/GLO）亚家族
• 6.3.3 AG-like亚家族
• 6.3.4 SEP亚家族
• 6.3.5 悬铃木进化地位
• 6.4 讨论
• 第七章 悬铃木选择压力及生物钟分析
• 7.1 前言
• 7.2 材料与方法
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 悬铃木A-,B-,C-,E-类MADs-box基因选择压力分析
• 7.3.2 悬铃木分子生物钟分析
• 第八章 讨论与展望
• 8.1 生物信息学与悬铃木基因克隆
• 8.2 悬铃木基因的多拷贝现象
• 8.3 悬铃木的进化地位
• 8.4 悬铃木PaFUL、PaAP3、PaAG、PaSEP1和PaSEP3受到的自然选择
• 8.5 悬铃木分子生物钟分析
• 8.6 悬铃木不育系的诱导
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ:缩略词表
• 附录Ⅱ:本研究所用到的基因信息
• 附表2-1:本研究用到的LFY同源基因
• 附表2-2:本研究用到的A-类MADS-box同源基因
• 附表2-3:本研究用到的B-类MADS-box同源基因
• 附表2-4:本研究用到的C/D-类MADS-box同源基因
• 附表2-5:本研究用到的E-类MADS-box同源基因
• 附表2-6:本研究用到其它MADS-box同源基因
• 附录Ⅲ:悬铃木看家基因PaActin的核苷酸序列
• 附录Ⅳ:Genebank注册基因信息
• 附录Ⅴ:博士期间发表论文及相关成果等情况
• 致谢