一种吲哚咔唑类化合物MDZ-03的抗肿瘤作用研究以及PKC抑制剂筛选模型的建立

论文摘要

蛋白激酶C（PKC）是一类Ser/Thr蛋白激酶家族,参与细胞内多种功能的信号转导过程,包括增殖、分化、凋亡以及血管生成等。PKC目前已发现至少11种亚型,按其对Ca2+和甘油二酯（DAG）的依赖性不同,可以分为三个主要的亚家族:经典型PKC,新型PKC,非经典型PKC以及PKCμ。早期研究表明PKC能够被促肿瘤剂佛波酯（PMA）激活,随后的大量研究进一步证实PKC在肿瘤的发生、发展和转移中均发挥着重要作用,因此将其作为靶点开发抗肿瘤药物成为目前研究的热点。目前已开发了多种PKC抑制剂,如UCN-01、PKC412、Go6976、Rottlerin、Bryostatin-1、Aprinocarsen等,其中已有一些抑制剂和寡聚核苷酸药物进入临床抗肿瘤研究,但是也带来了许多问题,包括药物体内药效仍不十分理想,靶点专一性较差,毒副作用较强,易产生耐药性等,针对PKC靶点寻找高效低毒的抗肿瘤药物仍然具有现实意义与挑战性。因此,建立以PKC为分子靶点的抑制剂筛选模型,将为开发抗肿瘤药物提供活性筛选的技术平台。实验室前期发现代号为MDZ-03的化合物对PKCβⅡ激酶活性表现出明显的抑制作用,并进行了初步的细胞水平抗肿瘤评价。本论文旨在对MDZ-03的体外体内抗肿瘤作用进行进一步评价,考察其对多种细胞株的增殖抑制作用以及对细胞周期的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。此外,建立基于生物发光原理的PKCα和PKCβⅡ分子水平抑制剂筛选模型,对MDZ-03的一系列类似物进行了筛选,以期寻找靶向更明确,作用更有效的PKC抑制剂抗肿瘤先导化合物。第一部分:MDZ-03的抗肿瘤作用及机制研究本部分实验评价了MDZ-03的体外体内抗肿瘤作用,考察其对多种细胞株的增殖抑制作用以及对细胞周期的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。结果观察到MDZ-03在体外对人慢性髓系白血病细胞K562、小鼠白血病细胞P388、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞435有选择性增殖抑制作用;MDZ-03作用使A549细胞浆出现大量空泡;流式细胞术表明MDZ-03将A549细胞周期特异性阻滞于G0/G1期;MDZ-03对荷A549裸小鼠异体移植瘤有体内抑瘤作用;Western Blot考察MDZ-03对A549细胞内PKC及其相关信号分子蛋白的影响,发现MDZ-03对PKCβⅡ、PKCδ、PKCθ均有抑制作用,并且可能不是通过凋亡通路,而是通过自噬介导细胞的死亡过程。第二部分:基于生物发光原理的PKCα和PKCβⅡ分子水平抑制剂筛选模型的建立本部分实验成功构建了基于生物发光原理的PKCα和PKCβⅡ分子水平抑制剂筛选模型,该模型稳定可用,并对54个化合物进行了筛选,得到了对PKCα和PKCβⅡ有抑制作用的候选化合物以供后续研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 第二部分 MDZ-03的抗肿瘤作用及机制研穷
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验试剂与材料
• 2.2.2 缓冲液及其他溶液
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 细胞株和细胞、动物培养
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 MDZ-03 对A549 作用的细胞形态变化观察
• 2.3.2 MTT 法测定MDZ-03 对多种细胞株的增殖抑制作用
• 2.3.3 流式细胞仪测定 MDZ-03 作用后 A549 细胞周期的变化
• 2.3.4 MDZ-03 对裸小鼠异体移植瘤的体内抗肿瘤作用
• 2.3.5 PMA 刺激对A549 细胞中PKC 活化的时间观察
• 2.3.6 MDZ-03 对PMA 刺激引起的A549 内信号分子变化的作用观察
• 2.3.7 MDZ-03 对A549 细胞内PKCβⅡ下游信号分子的作用观察
• 2.3.8 吖啶橙（AO）染色观察MDZ-03 是否引起A549 的自噬
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 MDZ-03 作用对A549 细胞形态的影响
• 2.4.2 MTT 法检测MDZ-03 对多种细胞株的增殖抑制作用
• 2.4.3 MDZ-03 对A549 细胞周期的影响
• 2.4.4 MDZ-03 对荷A549 裸小鼠异体移植瘤的影响
• 2.4.5 PMA 对A549 细胞内PKC 磷酸化水平的影响
• 2.4.6 MDZ-03 对 PMA 刺激引起的 A549 细胞内 PKC 各亚型磷酸化的影响
• 2.4.7 MDZ-03 对A549 细胞内PKC 下游信号分子的影响
• 2.4.8 MDZ-03 对A549 细胞内凋亡相关蛋白的影响
• 2.4.9 吖啶橙染色观察MDZ-03 对A549 的作用
• 讨论
• 小结
• 第二部分 基于生物发光原理的 PKCα、PKCβⅡ分子水平抑制剂筛选模型的建立
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验试剂与材料
• 3.2.2 常用缓冲液及其他溶液
• 3.2.3 待筛化合物和阳性对照化合物
• 3.2.4 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 基于生物发光原理的PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选模型的建立
• 3.3.2 基于生物发光原理的PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选体系的验证
• 3.3.3 利用基于生物发光原理的 PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选模型筛选候选化合物
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 基于生物发光原理的PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选模型的建立
• 3.4.2 基于生物发光原理的PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选体系的验证
• 3.4.3 利用基于生物发光原理的 PKCα、PKCβⅡ抑制剂筛选模型筛选候选化合物
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文