论文摘要
背景目的:牙周病是一波及广、危害大的口腔感染性疾病,该疾病严重影响人们的咀嚼消化功能,导致牙齿脱落,还可以成为某些全身疾病的危险因素,所以牙周病一直是国内外学者关注的焦点。由于牙周病慢性、迁延的特点,加之耐药性的产生,目前治疗效果尚不理想,寻找新的药物和新的用药方法受到关注。前期我们针对牙周病的病因及病理特点,筛选以复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星合理配伍,在体外抑菌实验研究上取得了满意效果;并依牙周生理外形特点,采用新的缓释材料,设计出适用于不同牙位、不同深度、符合前后牙周袋形态的牙栓,克服了液体制剂易流失,凝胶制剂易污染,固体制剂需修剪等缺点。为了进一步的开发应用,本研究对该缓释牙栓进行了系列动物毒理学试验研究;牙栓在牙周袋中抑菌消炎的同时必然也会作用于牙周组织,而人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）是牙周组织的主要功能细胞,在创伤修复和组织再生中发挥着重要作用,进行相关分析探讨缓释牙栓对HPDLF的生物学活性的影响,为进一步动物、临床试验提供试验依据。方法:1.采用冷压法自制复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓,自然凉干,紫外照射30min,消毒备用,每枚重10mg,含原药量1mg。2.以1 L蒸馏水缓释牙栓的最大浓度剂量即210 g/L,制成混悬液,按0.4ml/10g最大允许容积一次给予昆明小鼠灌胃,连续观察14 d,观察小鼠接受过量受试药物所产生的急性中毒反应,为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析人体过量时可能出现的毒性反应。3.将40只SD雌雄大鼠,平均分到4个组中;①小剂量组:按每日5g/kg给药;②中剂量组:按每日10g/kg给药;③大剂量组:按每日20g/kg给药;④空白对照组:按等容量的生理盐水灌胃。观察动物反复给予受试药物后,对机体产生的毒性反应及其严重程度,主要的毒性靶器官及其损害的可逆性,提供无毒性反应剂量及临床上主要的监测指标,为制定人用剂量提供参考。4. 40只豚鼠平均分为4组进行皮肤过敏试验:①空白对照组;②缓释牙栓组（210g/L）;③辅料基质组;④阳性对照组。试验前24 h在豚鼠背部两侧,剪出3cm×3cm的去毛区,观察缓释牙栓对皮肤的影响。5.将20只SD大鼠下唇缝成一盲袋,然后随机分为2组,分别用缓释牙栓（210g/L）及等体积基质注入袋内,了解药物对牙周粘膜毒性及刺激的影响。6.选择经2%荧光素钠溶液检查证实,无角膜损伤的健康新西兰兔6只,将缓释牙栓（210g/L）滴入右眼结膜囊内,观察药物对眼部刺激的影响。7.利用免疫组化ABC法对原代培养的HPDLF,进行波形丝蛋白和角蛋白单克隆抗体染色,作细胞来源鉴定。8.取生长良好的第5代HPDLF,制备成浓度为4×107 /L细胞悬液,每孔加入浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L经DMEM缓释的牙栓,单纯加培养液作空白对照,于不同时间用酶标仪检测各个浓度缓释牙栓OD值,评定药物对细胞增殖的影响。9.取在标准环境下培养24 h的96孔培养板HPDLF,加入浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L经DMEM缓释的牙栓,每孔加入1μCi3H-TdR,在液闪记数仪上测量每分钟闪烁记数（cpm）,评定药物对HPDLF DNA合成的影响。10.将加有不同浓度缓释牙栓的96孔板HPDLF,每孔加入100μl 0.2% TritonX-100,考马斯亮兰染,在波长570处检测OD值,探讨缓释牙栓对HPDLF蛋白含量的影响。结果:1.经一次性给予最高浓度（210g/L）,及小鼠最大灌胃容量（0.4ml/10g）缓释牙栓后,小鼠无一中毒死亡,小鼠对缓释剂的MTD为8.4g/kg。按公斤体重计算,相当于50kg成人每日用量（假设32颗牙齿均用药,每颗牙放置10mg牙栓一枚）的1300倍以上。2.缓释牙栓组与对照组大鼠,在60 d试验期内均活动正常、行为活泼、毛发光泽,无一死亡;体重增长基本一致;血常规、肝肾功检验未见显著性差异;5个脏器的比重量与对照组相比无统计学差异;经病理切片镜下检查,心肌纤维横纹清晰,细胞分化好;肝小叶结构清晰,肝细胞分化良好;未见肾小管变性坏死,间质无出血或炎症;脾无水肿;肺无充血、水肿和炎症反应。3.口腔粘膜完整,缓释牙栓组与基质组无差异,粘膜病理切片未见改变。4.缓释牙栓组动物自给药72 h内未出现红斑及水肿,与空白对照组无差异;基质组无致敏现象;阳性对照组动物皮肤受试区自激发给药6 h后,有明显轻度红斑出现,无水肿,致敏率100%。5.新西兰兔眼部刺激试验出现结膜充血,轻微水肿,少量分泌物,评分≤3分。在用药48 h后全部消失,为可逆变化,由于大多数人认为兔眼较人眼敏感,因此可以推测牙栓缓释剂对人眼基本无刺激性。6.原代HPDLF呈长梭形,胞质均匀,核呈圆形或椭圆形,核仁清晰,免疫组化染色表明,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。7.经单因素方差分析的结果显示缓释牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L时OD值与对照组相比没有显著性差异（P>0.05）。8.缓释牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L浓度时,与对照组比,蛋白质OD值、DNA合成均无显著性差异（P>0.05）。结论:1.自制复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓每一批次制备规范,粒差小,体外缓释稳定,符合2005年版《中国药典》对栓剂的规定。2.急、慢性毒性试验结果表明缓释牙栓无明显毒性作用,大鼠的一般状态、行为活动、饮食、尿便、体重增长、血液学、血液生化学及主要脏器系数与对照组比较均未见明显差异,各脏器病理学检查均未见明显药物损害性病理改变,无局部刺激作用及过敏反应,不同动物对该缓释牙栓有很大的耐受性,提示该药的使用安全性高。3.免疫组化染色表明,证明所培养的细胞为来自中胚层的成纤维细胞。4.在200 g/L缓释浓度范围内,该缓释牙栓有较佳的生物相容性,未显示有HPDLF抑制作用。
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