人NR2B基因脑部特异性暂态表达大鼠模型的建立

论文摘要

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体是一种配体门控型离子通道,主要分布在突触后膜,被认为是神经元突触可塑性及长时增强效的主要调控者。NR2B是该受体的主要调节亚单位,M2亚基上天冬氨酸残基形成的Asn环是NMDA受体的中心部分,决定该离子通道的通透性及电导性。血脑屏障是由毛细血管内皮细胞和神经胶质细胞的紧密连接构成的,一般物质不容易通过。在脑部靶向性运载中可以通过血脑屏障上高表达的转铁蛋白受体进行转运,所以带有小鼠抗大鼠转铁蛋白受体单抗（OX26）的免疫脂质体使药物或外源基因到达大鼠脑部是一个较好的方法。本研究通过RT-PCR的方法成功地克隆了NR2B基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-NR2B（PN）,转染CHO、未分化PC12细胞,经RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光（IFA）实验证明了构建的重组质粒可在细胞中表达NR2B基因;流式细胞仪检测到转染的未分化PC12细胞在受体激动剂诱导下能发生部分凋亡,CHO细胞未发生凋亡。用PCR方法扩增增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,构建得到pcDNA3.1-EGFP （PE）载体;用PCR方法克隆人突触素蛋白SynI的启动子,插入到去除CMV启动子的PE载体,得到SynI-pcDNA3.1（-CMV）-EGFP（SPE）载体,将该载体转染CHO,COS,PC12细胞系,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测,发现前两种细胞中SynI启动子几乎不能启动EGFP的表达,而在神经样PC12细胞中启动效率较高,说明其更倾向于在神经类细胞中发挥作用。再将NR2B基因插入到SynI-pcDNA3.1（-CMV）载体,得到SynI-pcDNA3.1（-CMV）-NR2B（SPN）重组质粒。用逆相蒸发法将NR2B重组质粒制备成脂质体,将OX26巯基化后与脂质体连接成免疫脂质体,获得的脂质体包封率达30.4%,呈粒径均匀的近球状小囊泡、平均粒径低于100 nm,OX26较为均匀的附着在脂质体周围,免疫脂质体直接ELISA反应呈阳性,SDS能够释放其包裹的DNA,说明成功制备了免疫脂质体。将大鼠分成三组,第一组为正常对照组,第二、三组分别尾静脉注射包裹PN,SPN质粒的免疫脂质体,48h取大脑皮层、海马、肝、脾经RT-PCR、定量PCR、Western blot、免疫组织化学方法（IHC）检测NR2B的表达,在第二组的大脑、肝、脾;第三组的大脑都能检测到NR2B的表达,CMV启动子下的NR2B表达量明显高于SynI启动子,但是后者能够特异性的表达于大脑,而前者则是广泛性表达。本研究使用组织特异性启动子和免疫脂质体技术而不使用病毒类载体使基因在脑内特异性的表达,在非靶向组织沉默;建立NR2B基因脑部特异性暂态表达大鼠模型,为与NR2B相关的学习、记忆、神经疾病的治疗寻找一种有效的方法,也为脑部靶向性的基因药物和基因治疗寻找一种有效的DNA投递系统。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述一：NR28 分子生物学研究进展
• 综述二：脑靶向免疫脂质体的研究进展
• 第一部分 人NR28基因和synapsin I启动子的克隆及其表达载体的构建
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 参考文献
• 第二部分 synapsin I启动子驱动EGFP特异性表达及NR28在真核细胞中的表达
• 1.材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4.讨论
• 参考文献
• 第三部分 包裹NR28重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析
• 1.材料
• 2 方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 参考文献
• 第四部分包裹NR28重组质粒免疫脂质体在大鼠体内的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文