NgR特异性RNAi对EAE大鼠脑内NgR表达、小胶质细胞及髓鞘修复的影响

论文摘要

目的多发性硬化是中枢神经系统（Central nervous system, CNS）常见的自身免疫性疾病,以慢性炎性脱髓鞘为主要病理改变。在青壮年发病率相对较高,其具体的发病机制不明,缺乏有效的特异性治疗,具有较高的致残率。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是研究多发性硬化常用的动物模型,该模型在临床、病理、生化等方面均能很好地模拟多发性硬化的发病过程。Nogo受体（nogo receptor,NgR）是轴突再生抑制因子Nogo-A,髓鞘相关糖蛋白（Myelin-associated glycoprotein, MAG）,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（Oligodendrocyte Myelin glycoprotein, OMgp）的共受体,因而在CNS损伤后轴突再生障碍中起重要作用。近来有研究表明在周围神经损伤的动物模型中,NgR可能可引导损伤部位巨噬细胞的清除,从而起到调节炎症的作用。此外,有研究表明在多发性硬化病人的脑组织中NgR的表达是增高的。这些都提示NgR在CNS免疫性疾病中可能具有免疫调节的作用。近年来,基因沉默技术中的短链RNA干扰（short interfering RNAs, siRNAs）技术可高度特异性降解目的基因,且不引起非特异性干扰反应,因而对揭示某疾病中表达异常增高的基因或蛋白的功能是非常有用。小胶质细胞是中枢神经系统中常驻的单核吞噬细胞之一,其在功能及形态上与巨噬细胞具有许多相似之处,参与脑内的炎症反应,并可能参与髓鞘的损伤与修复过程。因此,通过重组腺病毒为载体的NgR特异性shRNA转染EAE大鼠脑组织,并观察转染前后小胶质细胞及髓鞘的情况,可有助于阐述NgR在EAE中是否具有调节小胶质细胞及髓鞘再生的作用。本研究拟探讨：1在EAE动物模型中,NgR的的表达是否增高,以及小胶质细胞的数量变化及激活等情况；2以重组腺病毒为载体的NgR特异性shRNA转染EAE大鼠的侧脑室,转染后EAE大鼠脑组织NgR基因及蛋白表达的变化,以及转染后EAE脑组织小胶质细胞的数量及激活情况的变化；3该转染对EAE大鼠临床发病及脑组织炎性细胞聚集、髓鞘缺失情况的影响。从而揭示NgR在多发性硬化中可能具有的调节小胶质细胞及髓鞘再生的作用。为阐明多发性硬化等中枢神经免疫性疾病的发病机制提供理论依据,并为其基因治疗的临床应用奠定基础。方法1.建立Wistar大鼠EAE模型,运用MRI扫描、HE染色、Luxol Fast Blue染色等方法鉴定EAE模型制备是否成功；通过免疫荧光染色观察EAE脑组织中NgR表达是否上调,以及巨噬/小胶质细胞的数量是否增加及其活化情况。2.应用人胚肾293细胞扩增重组腺病毒,采用赛多利斯腺病毒纯化试剂盒纯化、收集重组腺病毒,通过TCID50测定病毒滴度；用等体积的高、中、低滴度的重组腺病毒转染EAE大鼠侧脑室,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）的表达,采用HE染色观察局部炎症反应,从而筛选出最佳的转染滴度。3.用中滴度的Ad-shRNA-NgR、Ad-shRNA-Hk分别转染重组腺病毒载体Ad-shRNA-NgR干预组（特异性RNAi组）及重组腺病毒载体Ad-shRNA-HK干预组（阴性对照组）,空白对照组以等量的PBS代替。在转染后第7及14天取材,通过RT-PCR观察转染后脑组织NgRmRNA的表达,免疫荧光染色观察转染后脑组织NgR蛋白的表达情况以及小胶质细胞的数量变化及激活情况,行HE、Luxol Fast Blue染色以观察炎性反应、髓鞘缺失等组织病理学变化,并对各组大鼠的临床转归进行记录。结果1.所制备的EAE模型在MRI及病理学方面的改变符合经典EAE表现。EAE脑组织中NgR的表达上调,小胶质细胞数量增加,并以激活的小胶质细胞为主。2.以GFP标记了的重组腺病毒转染293细胞后,转染后第24-72小时,荧光显微镜下观察发现：GFP表达逐渐增多。经扩增、纯化后得重组腺病毒Ad-shRNA-NgR及Ad-shRNA-Hk的滴度分别为：2.93×1010pfu/ml,2.84×1010pfu/ml。高、中、低滴度组EAE大鼠脑组织均出现GFP阳性表达,且高、中滴度组转染效率明显高于低滴度组,但高滴度组与中滴度组的GFP表达无明显差异。HE染色显示,高滴度组大鼠脑组织转染局部有明显急性炎性反应,其余组转染局部未发现明显炎性反应。3.转染后第7天（d14）：特异性RNAi组脑组织中NgR mRNA及蛋白的表达明显下降（p<0.01）,小胶质细胞的表达及髓鞘缺失情况与阴性及空白对照组未见明显差异。转染后第14天（d21）：特异性RNAi组脑组织中NgR mRNA及蛋白表达仍低于空白及阴性对照组（p<0.01）,但较该组转染后第7天时有所增加（p<0.05）；小胶质细胞的数量较空白及阴性对照组多（p<0.05）,且以活化状态为主；髓鞘缺失的恢复较空白及阴性对照组好（p<0.05）。4.与空白及阴性对照组比较,特异性RNAi组大鼠的发病潜伏期延长（p<0.05）、临床症状评分减轻（p<0.05）；d21时的髓鞘缺失缓解略明显；d21时,病灶部位内的炎性细胞消退较慢。结论EAE模型的制备是成功的。中滴度的腺病毒可高效、安全地转染EAE脑组织。NgR特异性RNAi可明显降低EAE脑组织中NgR基因及蛋白的表达,并有利于髓鞘缺失的修复,但对于激活的小胶质细胞的早期清除不利。该现象可能是通过病灶内激活的小胶质细胞启动了髓鞘再生的修复机制,从而促进髓鞘再生。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Wistar大鼠EAE模型的建立及其评价
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定及其转染EAE脑组织安全性的评价
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第三部分 NgR特异性RNAi对EAE大鼠脑组织中NgR表达、小胶质细胞及髓鞘修复的影响
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 结论
• 图片
• 参考文献
• 文献综述 NgR在神经损伤和神经免疫方面的研究进展
• 致谢
• 攻读硕士学位期间撰写文章目录