兔GnIH及其受体基因的克隆和mRNA在组织器官的表达

论文摘要

促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH）是Tsutsui等人2000年首先在鸟类发现的一种含有12个氨基酸的精氨酰-苯丙酰胺（RF酰胺）神经肽,含有GnIH的神经元胞体主要位于下丘脑室旁核,他可抑制培养的鹌鹑垂体前叶细胞促性腺激素的释放,故将其命名为促性腺激素抑制激素。在哺乳动物也发现了GnIH的类似物,有’3种,其C端具有RF酰胺,称RF酰胺相关肽（RFRP）,具有与GnIH类似的作用。GnIH通过其受体发挥生理作用,具有抑制促性腺激素合成和分泌的作用,还有促进禽类摄食的作用。由于GnIH及其受体在脑和许多器官内分布,提示他可能具有多种生物学作用,还有待研究。在人、大鼠和小鼠等动物有关GnIH的研究报道较多,但未见兔GnIH及其受体的基因克隆和mRNA在组织器官表达的研究,本文用RT-PCR的方法进行了这方面的研究,结果如下：1.利用RT-PCR等方法克隆了兔GnIH及其受体NPFFR-1和NPFFR-2的部分核苷酸序列,并将其登录在GenBank数据库中,登录号分别为HM744733、 JF826513和JF907578。克隆的兔GnIH基因可编码3种C端含有LPXRF （X为L或Q）酰胺肽,即GnIH-RP-1、GnIH-RP-2和GnIH-RP-3,所有这些肽的序列具有甘氨酸C端酰胺化信号。GnIH-RP-1的序列为MPHAAATLPLRFGR, GnIH-RP-2的序列为SPQPVANLPLRFGR, GnIH-RP-3的序列为IPNLPQRFGR.2.利用生物信息学分析软件对兔GnIH及其受体的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果发现,兔GnIH基因核苷酸序列与绵羊、牛、猕猴、人类等哺乳动物的核苷酸同源性分别达88%、83%、83%、82%、,与野猪、黑线毛足鼠、小鼠同源性较低,分别为79%、77%、75%,预测的氨基酸同源性和核苷酸同源性基本相符。兔NPFFR-1和NPFFR-2的核苷酸和氨基酸序列与其它物种均具有较高的同源性,跨膜分析显示这两个受体氨基酸具有典型的跨膜结构。3.用半定量RT-PCR的方法研究GnIH及其受体mRNA在兔体内的表达情况,结果显示,GnIH在眼球壁表达最高,下丘脑次之。在肝、肾、肾上腺、垂体、杏仁核、脊髓、嗅球、脑桥、小脑、延髓、海马、卵巢、睾丸、附睾、心、脾、胰也有表达。其受体在中枢神经系统和外周均有广泛分布,其中NPFFR-1在下丘脑、中脑、小脑、梨状叶、杏仁核、延髓、嗅球、脊髓、海马、垂体、脑桥、卵巢、睾丸、附睾、子宫、膀胱、眼球壁、食管、乳腺、胰腺、胸腺、十二指肠等广泛分布。NPFFR-2在下丘脑、中脑、卵巢、睾丸、眼球壁、肾上腺、梨状叶、杏仁核、延髓、嗅球、脊髓、海马、垂体、脑桥等有不同程度的表达。这些结果与在其它动物上获得的结果基本相似。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 Gonadotropin-inhibitory hormone的研究进展
• 1 GnIH的发现与命名
• 2 GnIH的结构与分布
• 2.1 GnIH的结构
• 2.2 GnIH的分布
• 3 GnIH受体结构与分布
• 3.1 GnIH受体的结构
• 3.2 GnIH受体的分布
• 4 GnIH的生物学效应
• 4.1 GnIH对生殖的调节作用
• 4.2 GnIH的其他作用
• 5 GnIH调控动物生殖的作用机制
• 6 GnIH的研究与应用前景
• 参考文献
• 第二章 兔GnIH及其受体基因的克隆与序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物及取材
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 主要分子生物学试剂
• 1.4 试剂的配制
• 1.5 仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 兔各组织RNA提取及检测
• 2.2 RT-PCR
• 2.3 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序
• 2.4 GnIH及其受体的组织表达
• 3 结果
• 3.1 总RNA提取结果
• 3.2 RT-PCR结果
• 3.3 测序结果
• 4 讨论
• 4.1 总RNA的提取
• 4.2 引物设计
• 4.3 克隆测序分析
• 4.4 GnIH、NPFFR-1和NPFFR-2基因核苷酸和预测的氨基酸序列分析
• 参考文献
• 第三章 兔GnIH及其受体mRNA在组织器官的特异性表达
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物与取材
• 1.2 主要试剂与仪器设备
• 1.3 总RNA的提取
• 1.4 总RNA样品的反转录（RT）
• 1.5 引物设计与PCR反应
• 1.6 电泳及灰度值分析
• 2 结果
• 2.1 总RNA提取结果
• 2.2 GnIH及其受体mRNA在兔组织器官中表达的结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢