鱼腥蓝细菌PCC 7120中细菌酪氨酸激酶和小分子量酪氨酸磷酸酶的功能研究

论文摘要

鱼腥蓝细菌PCC7120（Anabaena sp.PCC7120）是一种丝状蓝细菌,具有生物固氮功能。当环境中缺乏化合态氮源的时候,菌丝上每隔10-20个营养细胞就会有一个发育成为异形胞,固定空气中的氮气。异形胞的固氮产物会输送给周围的营养细胞,营养细胞则为异形胞提供其生命活动所需要的碳源,整条菌丝由此维持在缺氮环境下的生长。细菌酪氨酸激酶（BY-kinasese）和小分子量酪氨酸磷酸酶（LMW-PTP）是催化细菌中酪氨酸可逆磷酸化反应的主要调控蛋白,参与细菌中胞外多糖的输出过程。在本研究中,首次发现在鱼腥蓝细菌中alr2856、alr3059和all4432基因编码了细菌酪氨酸激酶。构建这三个基因的缺失突变体载体,筛选得到双交换突变体,缺氮诱导以后发现单个基因的突变没有引起明显的表型。同时,还对鱼腥蓝细菌PCC7120中的小分子量酪氨酸磷酸酶的编码基因进行了研究。酶学特性的研究表明A1r5068是一个典型的小分子量酪氨酸磷酸酶,它能催化磷酸化的细菌酪氨酸激酶去磷酸化,点突变Alr5068的催化活性位点导致其磷酸酶活性丧失。在鱼腥蓝细菌体内,Alr5068的超表达菌株Ox5068在缺氮以后能够发育正常的有功能的异形胞,但菌丝易断裂,异形胞脱落导致Ox5068不能生长。Alr5068的点突变超表达菌株OxR15K在缺氮以后,不能形成异形胞多糖层,固氮酶活下降,细胞不能正常生长。在OxR15K菌株中,异形胞多糖合成基因hepA和hepC的转录在缺氮以后受到抑制。以上结果表明,Alr5068参与了异形胞包被多糖层的形成,为研究异形胞特异性多糖的聚合与输出过程提供了新的思路和途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 縮略语表
• 1 前言
• 1.1 蓝细菌简介
• 1.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞发育进程简述
• 1.2.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞形态及生理特点
• 1.2.2 异形胞发育进程
• 1.3 细菌的酪氨酸磷酸化
• 1.3.1 细菌型酪氨酸激酶（BY-kinases）
• 1.3.2 酪氨酸磷酸酶
• 1.3.3 BY-kinases和LMW-PTP的生理功能
• 1.4 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基配方以及培养条件
• 2.3 主要分子生物学试剂
• 2.4 缓冲液和反应试剂
• 2.4.1 E.coli感受态细胞制备试剂
• 2.4.2 蛋白质纯化试剂
• 2.4.3 磷酸化反应试剂
• 2.4.4 Western Blot试剂
• 2.4.5 蛋白胶银染溶液
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 质粒DNA的制备及相关操作
• 2.5.2 质粒构建
• 2.5.3 质粒DNA的转化
• 2.5.4 His-tag融合蛋白质的诱导和纯化
• 2.5.5 Bradford法蛋白质定量
• 2.5.6 蛋白激酶的自磷酸化和底物磷酸化反应
• 2.5.7 磷酸酶去磷酸化反应
• 2.5.8 磷酸酶活性测定
• 2.5.9 PULL-DOWN实验
• 2.5.10 变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳
• 2.5.11 蛋白胶的银染
• 2.5.12 Western Blot
• 2.5.13 鱼腥蓝细菌PCC 7120总DNA的抽提
• 2.5.14 鱼腥蓝细菌PCC 7120的三亲本杂交
• 2.5.15 接合转移子的验证
• 2.5.16 鱼腥蓝细菌PCC 7120的缺氮诱导
• 2.5.17 鱼腥蓝细菌PCC 7120 RNA的提取和纯化
• 2.5.18 反转录RNA及实时荧光定量反转录PCR（Real-time RT PCR）
• 2.5.20 固氮酶活性的测定
• 2.5.21 鱼腥蓝细菌PCC 7120胞外多糖的提取和测定
• 2.5.22 硫酸苯酚法测定多糖含量
• 3 结果与分析
• 3.1 BY-kinases和LMW-PTP的生物信息学分析与鉴定
• 3.1.1 BY-kinases的生物信息学分析
• 3.1.2 LMW-PTPs的生物信息学分析与鉴定
• 3.2 BY-kinases和LMW-PTP的体外酶活鉴定
• 3.2.1 BY-kinases自磷酸化活性检测
• 3.2.2 LMW-PTPs体外磷酸酶活性检测
• 3.3 Alr5068参与了鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞外壁特异性多糖层的形成
• 3.3.1 Alr5068超表达菌株Ox5068的构建
• 3.3.2 超表达菌株Ox5068的表型观察
• 3.3.3 Alr5068点突变超表达菌株的构建
• 3.3.4 Alr5068点突变超表达菌株OxR15K的表型
• 3.3.5 OxR15K的超微结构
• 3.3.6 Ox5068和OxR15K的固氮酶活性
• 3.3.7 Ox5068和OxR15K菌株中多糖合成相关基因hepA和hepC的转录
• 3.3.8 alr5068基因缺氮诱导后的转录水平
• 3.4 鱼腥蓝细菌PCC 7120中BY-kinases的基因功能研究
• 3.4.1 BY-kinases的缺失突变体和超表达菌株的构建与筛选
• 3.4.2 BY-kinases的缺失突变体和超表达菌株缺氮后的表型
• 3.4.3 BY-kinases的缺失突变体和超表达菌株总糖含量的测定
• 3.5 在鱼腥蓝细菌PCC 7120中寻找Alr5068互作蛋白
• 3.5.1 Alr5068双点突变蛋白的获得
• 3.5.2 突变蛋白Alr5068CD与作用底物共纯化
• 4 讨论
• 4.1 Alr5068是一个典型的LMW-PTP,在鱼腥蓝细菌PCC 7120基因组中具有不可替代的地位
• 4.2 BY-kinases家族的基因功能
• 4.3 Alr5068在异形胞特异性多糖形成过程中的作用
• 参考文献
• 附录一 本实验中所用引物
• 附录二 p35蛋白条带质谱结果
• 致谢