DNA分子标记技术在有毒植物鉴定中应用的评价研究

论文摘要

研究背景：在我国,植物由于其存在的广泛性,易于获得,以及我国有把植物作为食材或药材的传统等原因,有毒植物中毒成为对公众健康危害较为严重的公共卫生问题。而针对有毒植物中毒控制技术的开展却很少,特别是在有毒植物中毒现场中,由于很多时候无法获得有利于病因判定的完整的生物学证据,利用传统的形态标记技术、细胞学标记技术、生化标记技术均有一定局限性,导致有毒植物快速鉴定技术匮乏。DNA分子标记技术对材料要求不高,这种优越性可能有利于其应用于有毒植物的快速鉴定。常用于有毒植物的DNA分子标记技术为RAPD技术、ISSR技术及DNA条形码技术。目的：利用RAPD技术、ISSR技术、DNA条形码技术对我国常见有毒植物进行鉴定,以探讨DNA分子标记技术应用于有毒植物中毒快速鉴定的可行性；并从时效性、真实性、可靠性及可操作性4个方面评价RAPD技术、ISSR技术、DNA条形码技术对于常见有毒植物属级阶元分类水平的鉴定效能。研究方法：根据有毒植物中毒病例的文献报道、我国有毒植物资源调查以及野外实地考察的情况,选择毛莨科与大戟科共19种有毒植物作为研究对象。每种植物选用1份干燥叶片（或新鲜叶片）样品,基因组DNA提取方法为改良的CTAB法。RAPD技术从随机引物中筛选扩增条带清晰且重复性好的引物用于实验和统计分析,利用NYSTS软件与SPSS软件进行聚类分析,得到系统发育树,与形态学分类比较得到鉴定准确率,3人计数条带评估主观因素影响,重复3次试验计算条带重复率；ISSR技术筛选扩增条带清晰且重复性好的引物用于实验和统计分析,利用NYSTS软件与SPSS软件进行聚类分析,得到系统发育树,与形态学分类比较得到鉴定准确率,3人计数条带评估主观因素影响,重复3次试验计算条带重复率；DNA条形码技术利用生命条形码联盟推荐的引物用于PCR扩增测序,利用PAUP软件与MEGA软件进行聚类分析,得到系统发育树,与形态学分类比较得到其鉴定准确率,计算扩增及测序成功率,筛选最佳片段。重复3次以验证重复性。从时效性、真实性、可靠性与可操作性评价3种DNA分子标记技术对有毒植物的鉴定效能。结果：1.利用改良的CTAB法能够提取到19种植物的基因组DNA,浓度在100ng/μL以上,蛋白质及RNA污染较少。2.RAPD技术：从64条随机引物中筛选出3条引物,多态性条带比率为100%,未能鉴定研究对象科级阶元分类。主观因素影响率为43.75%-76.92%,条带重复率为30.77%-47.06%。3.ISSR技术：从30条引物中筛选出9条引物,最佳引物873属级阶元分类鉴定准确率68.42%,主观因素影响率为26.09%,条带重复率为45.00%。4.DNA条形码技术：筛选到最佳片段trnH-psbA对研究对象属级阶元分类鉴定准确率为100.00%,片段扩增成功率与测序成功率为100.00%,具有明显的Barcoding Gap。5.应用评价：时效性：RAPD技术与ISSR技术所需时间较短,在8.50-9.00h内可以完成鉴定,而DNA条形码技术则需要42.17h-54.17h。真实性：RAPD技术未能鉴定,ISSR技术属级阶元分类鉴定准确率为68.42%,DNA条形码技术属级阶元分类鉴定准确率为100.00%。可靠性：ISSR技术与RAPD技术的主观影响率大,条带重复率差。DNA条形码技术片段trnH-psbA可靠性很好。可操作性：RAPD技术与ISSR技术对PCR产物的量要求不多,而DNA条形码技术对PCR产物的量要求多；RAPD技术与ISSR技术对电泳条件要求更为苛刻；RAPD技术与ISSR技术可在实验室内部完成,实验成本相对低,DNA条形码技术需要机构配合,试验成本高；DNA条形码技术有权威的数据库GenBank可进行序列的比对,RAPD技术与ISSR技术缺乏权威数据库。结论：结合有毒植物中毒现场的情况及需求,从时效性、真实性、可靠性与可操作性4个方面评价3种常用的DNA分子标记技术,表明RAPD技术与ISSR技术时效性优于DNA条形码技术；DNA条形码技术真实性与可靠性优于RAPD技术与ISSR技术；可操作性方面,3种方法都有一定的局限性,但是DNA条形码技术的局限性更容易解决。所以初步认为DNA条形码技术能够成为突发中毒事件病因分析中的有力工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 前言
• 第一章 研究背景和目的
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目的
• 第二章 研究对象和方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总DNA提取
• 2.2.2 PCR反应及测序
• 2.2.3 数据处理
• 2.2.4 应用评价
• 第三章 研究结果
• 3.1 DNA浓度与纯度
• 3.2 RAPD技术
• 3.2.1 RAPD扩增
• 3.2.2 系统发育树及准确率
• 3.2.3 主观性
• 3.2.4 重复性
• 3.3. ISSR技术
• 3.3.1 ISSR扩增
• 3.3.2 系统发育树及准确率
• 3.3.3 主观性
• 3.3.4 重复性
• 3.4. DNA条形码技术
• 3.4.1 扩增成功率与测序成功率
• 3.4.2 Barcoding Gap检验
• 3.4.3 系统发育树及准确率
• 3.5 应用评价
• 3.5.1 时效性
• 3.5.2 真实性
• 3.5.3 可靠性
• 3.5.4 可操作性
• 第四章 讨论
• 4.1 有毒植物基因组DNA的提取
• 4.1.1 样品形式
• 4.1.2 提取方法
• 4.2 RAPD技术
• 4.3 ISSR技术
• 4.4 DNA条形码技术
• 4.5 应用评价
• 4.5.1 时效性
• 4.5.2 真实性
• 4.5.3 可靠性
• 4.5.4 可操作性
• 第五章 建议
• 5.1 开展DNA条形码技术的标准方法与鉴定体系研究
• 5.2 建立我国DNA条形码序列信息库
• 5.3 开展不同形式样本提取基因组DNA的研究
• 5.4 高级阶元分类快速鉴定技术研究
• 参考文献
• 研究的局限性
• 综述
• 参考文献
• 致谢