论文摘要
目前,以手术、放疗、化疗和内分泌治疗为主的综合治疗模式提高了癌症患者的生存率,但卵巢癌的复发和转移率仍较高。生物治疗应用于卵巢癌的临床前实验研究取得了较大进展,给卵巢癌特别是晚期患者的治疗带来了新的希望。IL-24基因是一重要的抑癌基因,其过量表达能选择性地抑制黑色素瘤细胞分化并诱导其凋亡,如功能丧失将导致黑色素瘤生长加快并具侵袭性。国外学者利用IL-24基因的重组腺病毒制剂用于20株癌细胞进行实验,发现有19株癌细胞发生了凋亡。IL-24基因表达产物能诱导多种肿瘤细胞调亡,但不影响正常细胞,且具有通过刺激免疫应答来发挥抗肿瘤的活性。所以IL-24被认为具有广阔的临床应用前景,对其功能的研究极具理论和临床意义。为探索IL-24对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生物学的影响,本实验分为四个部分:第一部分IL-24真核表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24的构建及鉴定;第二部分稳定转染pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24的上皮性卵巢癌SKOV3细胞株增殖、细胞周期、凋亡率及相关凋亡蛋白的变化;第三部分IL-24对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株放疗敏感性的改变观察;第四部分稳定转染pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24的上皮性卵巢癌SKOV3细胞株裸鼠成瘤试验,IL-24对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株裸鼠移植瘤模型治疗试验研究。目的:IL-24真核表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24的构建及鉴定。方法:分离人外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,自行设计特异性引物,对IL-24编码序列进行克隆,通过基因重组,连接到pcDNA3.1-myc-his（-）B载体上,构建IL-24真核表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24,用PCR、酶切鉴定和序列测定证实序列无误后,大量扩增。结果:1、正常人外周血淋巴细胞中提取的总RNA质量检测:从正常人外周血淋巴细胞中提取的总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳,可见28s、18s、5s三条带,且28s的光密度值是18s的两倍,表示该RNA样品完整性好,降解少。2、总RNA经RT-PCR扩增IL-24基因:以总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,经琼脂糖凝胶电泳扩增出约为600+bp大小的特异性条带,与预期设计的IL-24 cDNA大小相符。3、PCR鉴定:以构建的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24为模板,PCR扩增IL-24 DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳,扩增出约为600+bp大小的特异性条带,与预期设计的IL-24 DNA大小相符。4、酶切鉴定:经蓝白筛选后,挑取数个单菌落扩增,提取质粒,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,可见被酶切的质粒出现两条带,约5.4Kb、600+bp大小,分别与pcDNA3.1-myc-his（-）B和IL-24基因片段大小一致。pcDNA3.1-myc-his（-）B上有两个XbaⅠ酶切位点,用XbaⅠ单酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳,可见被酶切的质粒出现两条带,约5.4Kb、600+bp大小,分别与pcDNA3.1-myc-his（-）B和IL-24基因片段大小一致。5、质粒的测序结果:对经上述鉴定后符合要求的质粒交invitrogen公司进行序列测定,经NCBI提供的BLAST程序分析对比,结果显示本实验获得的IL-24序列与genebank公布的IL-24基因序列完全一致,符合预期结果。结论:1、正常人外周血淋巴细胞中有IL-24 mRNA的表达。2、成功构建了IL-24真核重组表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24。目的:稳定转染pcDNA3.1-myc-his（-）B- IL-24的上皮性卵巢癌SKOV3细胞株增殖、细胞周期、凋亡率及相关凋亡蛋白的变化。方法:培养上皮性卵巢癌SKOV3细胞株,优化G418筛选浓度。将重组真核表达载体pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24电穿孔转染SKOV3细胞中,G418筛选后获得稳定表达IL-24分子的阳性细胞克隆。RT-PCR和Western Blot检测细胞转染前后IL-24 mRNA和蛋白的表达情况。细胞计数法绘制细胞生长曲线、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和平板克隆形成试验检测细胞体外增殖状况。倒置显微镜下观察细胞形态学改变。Hoechest 33258荧光染色法检测细胞凋亡。FCM（流式细胞仪）PI荧光染色分析细胞周期的改变,AnnexinV—FITC和PI荧光染色分析细胞凋亡率的改变。RT-PCR检测IL-24转染前后细胞p53 mRNA和caspase-3 mRNA的表达。结果:1、pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24转染生长良好的SKOV3细胞后,经G418筛选,未转染组全部死亡,1周后转染组形成少量细胞克隆,2周后转染组形成大/小克隆细胞团。2、用RT-PCR法检测SKOV3细胞转染pcDNA3.1-mvc-his（-）B-IL-24、转染pcDNA3.1-myc-his（-）B与未转染组细胞中IL-24 mRNA的表达。可见IL-24转染组SKOV3细胞,IL-24与GADPH扩增片断长度分别为600+bp、400+bp左右,空载体转染组与未转染组未见IL-24条带。表明SKOV3细胞未转染和空载体转染组无IL-24 mRNA表达或表达太低,转染后IL-24表达明显增加。3、Western Blot检测细胞转染前后IL-24蛋白的表达情况,可见IL-24转染组SKOV3细胞有IL-24蛋白（分子量大小为23.8KD）表达,未转染组和空载体组细胞中未见IL-24蛋白的表达。4、经细胞计数法测得各组的细胞数,绘制生长曲线。IL-24基因的导入可使上皮性卵巢癌SKOV3细胞株的活力受到明显抑制（P=0.000）。两两分析表明,转染IL-24的SKOV3细胞,细胞数与其它两组相比,差异具有统计学意义（P=0.000）。未转染组与转染空载体组细胞相比,差异无明显统计学意义（P=0.145）。5、MTT比色法测得细胞各组的吸光度值。经析因设计的方差分析表明,IL-24基因的导入可使上皮性卵巢癌SKOV3细胞的生长受到明显抑制（P=0.000）。两两分析表明,转染IL-24的SKOV3细胞增殖能力与其它两组相比,差异具有统计学意义（P=0.000）。未转染组与转染空载体的SKOV3细胞相比,差异无明显统计学意义（P=0.326）。6、细胞培养2周后可见接种三种细胞的平皿中均有明显的细胞集落形成。未转染、转染空质粒及转染IL-24真核表达载体的SKOV3细胞集落形成率分别为（62.00±0.05）%、（60.33±0.07）%及（51.67±0.04）%。三组细胞相比,F=3.055,P=0.12,无明显统计学差异。显微镜下计数每个克隆的细胞数,未转染、转染空质粒及转染IL-24真核表达载体的SKOV3细胞,每个克隆的细胞数分别为303±15.67、295±13.54及99±11.97,三组细胞相比,F=699.868,P=0.000,有统计学意义。经SNK-q法两两分析,转染空载体组与未转染组细胞每个克隆细胞数无显著统计学差异（P=0.326）,两者与IL-24转染组细胞之间每个克隆细胞数有显著性差异（P=0.000）。表明IL-24可抑制SKOV3细胞的增殖。7、倒置显微镜下观察细胞形态学改变,可见死亡细胞明显增多。Hoechest 33258荧光染色观察IL-24转染后细胞核的变化,可见未转染组及转染空载体组细胞发出较微弱的蓝色荧光,细胞核大小基本一致,为圆形或椭圆形,被染成均匀的淡蓝色,无明显的形态学改变,极少见到凋亡细胞和凋亡小体。IL-24转染组可见较多凋亡细胞,发出较强的蓝色荧光,细胞浆密度增大、颜色变深,细胞核体积变小,形态不规则,大小不一,见呈碎块状致密浓染,形状不规则的染色质,核膜呈境界分明的块状或新月形小体,有凋亡小体形成及核裂解。8、流式细胞仪检测IL-24转染后细胞周期变化,未转染、转染空载体及转染IL-24真核表达载体后的SKOV3细胞,G2/M期平均分别为4.29%、4.79%和12.88%。转染IL-24后的SKOV3细胞与未转染及转染空载体的细胞相比,G2/M期细胞比例明显增加,有统计学意义（F=309.805,P=0.000）。两两分析表明,未转染、空载体转染与IL-24真核表达载体转染的SKOV3细胞之间,G2/M期的细胞数有显著差异（P=0.000）。未转染与转染空质粒的SKOV3细胞相比,G2/M期细胞比例无明显变化,无统计学意义（P=0.233）。9、流式细胞仪检测IL-24转染后细胞凋亡率变化,未转染、转染空载体及转染IL-24真核表达载体后的SKOV3细胞,细胞凋亡率平均分别为3.33%,3.60%,14.51%,差异具有统计学意义（F=1205.073,P=0.000）。两两分析表明,未转染、空载体转染与IL-24转染的SKOV3细胞之间,细胞凋亡率有显著性差异（P=0.000）。未转染与空载体转染组之间,细胞凋亡率无显著性差异（P=0.318）。10、用RT-PCR法检测SKOV3细胞转染IL-24、转染空载体与未转染组细胞中p53 mRNA表达的变化,实验组和对照组均在600+bp左右处扩增出p53 mRNA特异性条带,在550bp左右处扩增出β-actinmRNA特异性条带,SKOV3未转染组、空载体转染组和IL-24转染组p53 mRNA相对表达量分别为0.43±0.005、0.44±0.004和0.44±0.005。实验组及对照组上皮性卵巢癌SKOV3细胞中p53 mRNA相对表达水平无显著性差异（F=3.000,P=0.125）。用RT-PCR法检测SKOV3细胞转染IL-24、转染空载体与未转染细胞中caspase-3 mRNA表达的变化,实验组和对照组均在260bp左右处扩增出caspase-3mRNA特异性条带,在550bp左右处扩增出β-actin mRNA特异性条带,SKOV3未转染组、空载体转染组和IL-24转染组caspase-3 mRNA相对表达量分别为0.26±0.005、0.20±0.004和0.64±0.003。实验组及对照组上皮性卵巢癌SKOV3细胞中caspase-3mRNA相对表达水平有显著性差异（F=1741.000,P=0.000）。结论:1.利用电穿孔转染可以将IL-24基因高效导入上皮性卵巢癌SKOV3细胞株;2.选择培养后的IL-24转染组SKOV3细胞,能稳定表达IL-24mRNA和蛋白,即建立了IL-24稳定表达的上皮性卵巢癌细胞模型;3.IL-24基因转染后对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株的体外增殖有抑制作用;4.IL-24基因能导致上皮性卵巢癌SKOV3细胞株G2/M期阻滞。5.IL-24基因表达增高对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株凋亡有促进作用。6.IL-24促凋亡的作用与p53无关,与caspase-3有关。目的:本部分拟观察将pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24真核表达质粒,稳定转染至上皮性卵巢癌SKOV3细胞表达后,是否能提高肿瘤细胞对放疗的敏感性。方法:稳定转染IL-24并筛选出阳性克隆之后,采用进口西门子直线加速器,单次照射上皮性卵巢癌SKOV3细胞。MTT比色法观察细胞增殖抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1、MTT比色法测SKOV3细胞各组的吸光度值。经析因设计的方差分析,经放射治疗后,IL-24基因的导入可使人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3的生长受到明显抑制（P=0.000）。两两分析表明,转染pcDNA3.1-myc-his（—）B-IL-24真核表达载体的SKOV3细胞,细胞增殖能力与其它两组相比,差异具有统计学意义（P=0.000）。未转染和转染pcDNA3.1-myc-his（—）B空载体的SKOV3细胞相比,差异无明显统计学意义（P=0.184）。2、未转染、转染空载体及转染IL-24后的SKOV3细胞,经6Gy放射线处理24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡率平均分别为6.90%,8.13%,20.12%。三组SKOV3细胞凋亡率的差异具有统计学意义（F=350.499,P=0.000）,各组之间两两比较发现,未转染组、空载体转染组与IL-24转染组SKOV3细胞之间,凋亡率有显著性差异（P=0.000）。而未转染组与空载体转染组之间,凋亡率无显著性差异（P=0.053）。结论:1.外源IL-24基因的过表达,可提高上皮性卵巢癌SKOV3细胞株对射线的辐射敏感性。目的:本部分拟建立上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤模型,用pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24真核表达质粒对上皮性卵巢癌荷瘤裸鼠进行治疗研究,观察IL-24是否能抑制上皮性卵巢癌荷瘤裸鼠癌细胞的生长。方法:建立人上皮性卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤模型,瘤体直接注射pcDNA3.1-myc-his（-）B-IL-24后,观察肿瘤体积、重量和抑瘤率。结果:1、pcDNA3.1-myc-his（—）B-IL-24真核质粒直接瘤体注射治疗上皮性卵巢癌荷瘤Balb/c nu/nu裸鼠后,肿瘤体积增长较慢,与未转染组及空质粒转染组相比,有显著差异（P=0.000）。2、IL-24治疗后抑瘤率为63.21%。pcDNA3.1-myc-his（—）B-IL-24真核质粒直接瘤体注射治疗上皮性卵巢癌荷瘤Balb/c nu/nu裸鼠后,肿瘤重量增长较慢,与未转染组及空质粒转染组相比有显著差异（P=0.000）。结论:1.IL-24可抑制上皮性卵巢癌SKOV3细胞株荷瘤裸鼠的肿瘤细胞生长。2.IL-24用于上皮性卵巢癌的基因治疗可能具有潜在价值。
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