植物内生菌A11抗菌物质的分离纯化、生物学活性及抑菌机制的初步研究

论文摘要

自青霉素发现以来,抗生素工业经历了快速的发展,抗生素作为重要的手段和工具在医学和农业上广泛使用。然而,在抗生素工业对人类生活作出巨大贡献的同时,问题也随之而来。药物滥用及其导致的细菌耐药性严重地影响抗生素的使用。目前,几乎所有的常用抗生素都具有相应的耐药菌株。包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的许多细菌还具有多重耐药性。因此,开发新型的抗生素成为重要的课题之一。近年来,植物内生菌被证实是新型活性物质的丰富来源。本实验室发现一株新型的植物内生菌,命名为A11。该菌在培养过程中表现出广谱抑菌活力,对几种重要的临床和农业病原菌都具有良好的抗菌特性。本实验对A11分泌的活性物质进行分离纯化,并对其生物学活性和抑菌机制进行初步研究。研究方法和结果如下：1.活性物质的分离纯化和初步鉴定。（i）48小时培养后的A11发酵液加入3倍体积的乙醇对活性物质进行抽提。溶解的活性物质经干燥后溶于甲醇溶液中。（ii）先后采用200-300、300-400目的硅胶对活性物质进行初步分离,洗脱方式为梯度洗脱,洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇体积比从9：1到0：10递减的混合溶剂。两次分离出的活性物质均出现在3：7和5：5洗脱液中,分别称为组分3和组分5。（iii）通过Sephadex LH-20凝胶层析柱对活性物质做进一步分离,洗脱条件如下：流动相为甲醇,洗脱速度为0.3mL/min,每隔l0min收集一个组分,结果在第20-26个组分区间里出现活性物质。（iv）活性组分最终进行反向高效液相色谱分离。洗脱方式采用梯度洗脱,洗脱剂为水和甲醇从9：1到0：10的混合溶剂。洗脱速度为1mL/min,柱温为25℃。结果表明活性物质对应于第3个层析峰。（v）质谱分析结果显示,组分3和组分5的分子量分别为338.52和339.41。MNR对样品的检测表明组分5活性物质至少含有7个碳原子。2.抗菌物质的生物学活性研究。（i）实验研究了活性物质和其他一些抗生素对一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和本实验室的标准非致病性金黄色葡萄球菌的抗菌效果。结果显示,All活性物质对于两个菌株显示出相同的抑菌效果,表现为抑菌圈大小相同。（ii）采用经典的倍比稀释法测定活性物质对指示细菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,结果显示活性物质的最低抑菌浓度为活性物质的甲醇原溶液用水稀释到1/1280-1/640,而最低杀菌浓度为活性物质的甲醇原溶液用水稀释到1/40-1/20。（ⅲ）利用96孔板法培养和测定不同浓度活性物质下细菌生物膜的细胞量,结果表明,即使是在亚MIC的浓度条件下活性物质也会影响生物膜的形成。3.活性物质抑菌机制的初步考察。（ⅰ）采用扫描电子显微镜的方法观察杀菌浓度、抑菌浓度作用下和不用药时的细菌形态学差别。结果显示,杀菌浓度作用下的金黄色葡萄球菌细胞大量出现皱缩、塌陷甚至破裂；而抑菌浓度作用下的葡萄球菌与不用药的细菌在显微镜下并无明显差异。（ⅱ）通过K+的释放程度检测活性物质对细胞膜的通透性的影响。活性物质处理后的细胞在1小时后K+释放迅速增高,在3小时后趋于平稳,表明活性物质在抑菌浓度下能够影响细菌细胞膜的透性。（ⅲ）实验对细菌在抑菌浓度条件作用前后的胞内蛋白的合成的差异情况进行研究。研究表明活性物质作用后的细胞表达的蛋白总量明显小于药物处理以前。尽管还必须考虑到这些现象和效应并无法指证它们就是活性物质作用的初原效应,因为这些结果可能是由于活性物质影响真正的靶点而造成的后续的效应,但这些研究对于抑菌机制的深入研究还是具有一定价值的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 内生菌作为生物活性产物资源库的依据
• 1.2 抗生素的分离纯化与鉴定
• 1.2.1 逆流色谱
• 1.2.2 毛细管电泳
• 1.3 抗生素机理研究
• 1.3.1 完整细胞水平上对机理的研究
• 1.3.2 部分纯化的无细胞体系中机制的研究
• 1.3.3 在纯化的酶体系中对活性的研究
• 1.3.4 遗传学和重组DNA方法
• 1.4 抗菌物质的开发
• 1.4.1 微生物学评价
• 1.4.2 试验性感染
• 1.4.3 毒性研究
• 1.4.4 药代动力学研究
• 第2章 引言
• 2.1 研究目的及意义
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 A11活性物质的分离、纯化和结构的初步分析
• 2.2.2 A11活性物质的生物学活性研究
• 2.2.3 A11活性物质的抑菌机理的初步探索
• 2.3 技术路线
• 第3章 A11活性物质的纯化和结构的初步分析
• 3.1 试剂与材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 内生菌A11的发酵
• 3.2.2 活性物质的抽提溶解
• 3.2.3 硅胶分离
• 3.2.4 排阻层析分离
• 3.2.5 活性物质的高效液相色谱法纯化
• 3.2.6 活性物质的质谱检测
• 3.2.7 活性物质的核磁共振检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 发酵液抗菌活性
• 3.3.2 活性物质的抽提溶解
• 3.3.3 硅胶分离结果
• 3.3.4 葡聚糖凝胶分离结果
• 3.3.5 高效液相纯化结果
• 3.3.6 活性物质的质谱检测结果
• 3.3.7 活性物质的核磁共振分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 活性物质的分离结果讨论
• 3.4.2 活性物质的结构分析
• 第4章 A11活性物质的生物学活性研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 A11活性物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑制作用
• 4.2.2 A11内生菌菌对各类抗生素的药敏性测试
• 4.2.3 活性物质杀菌浓度和抑菌浓度试验
• 4.2.4 生物膜实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 A11活性物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑制作用
• 4.3.2 A11内生菌菌对各类抗生素的药敏性测试
• 4.3.3 A11活性物质的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的确定
• 4.3.4 活性物质对生物膜的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 活性物质的最低抑菌浓度和杀菌浓度的分析
• 4.4.2 活性物质对耐药细菌抑菌效果的分析
• 4.4.3 活性物质对细菌生物膜影响性的实验结果分析
• 第5章 A11活性物质的抑菌机制的初步研究
• 5.1 试剂与材料
• 5 .1.1菌株
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 扫描电镜试验
• 5.2.2 细胞膜通透性实验
• 5.2.3 用药前后SDS蛋白质电泳实验
• 5.3 结果
• 5.3.1 电镜结果
• 5.3.2 细胞膜通透性实验
• 5.3.3 抑菌浓度活性物质作用前后的SDS-PAGE
• 5.4 讨论
• 5.4.1 活性物质对细菌细胞形态的电镜检测分析
• 5.4.2 活性物质对细菌细胞膜通透性的影响
• 5.4.3 活性物质对细菌蛋白质合成的影响
• 参考文献
• 致谢
• 读学位期间发表的文章