PAX3-FKHR/PAX7-FKHR和miRNA-1在眼眶横纹肌肉瘤分型及判断预后中的作用

论文摘要

横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）是儿童期最常见的原发性恶性肿瘤,占儿童全部恶性肿瘤的5%,占儿童所有软组织肉瘤的50%。该肿瘤起源于中胚叶未分化的多能间充质细胞,恶性程度高,发展快,病死率较高,严重威胁患者生命。眼眶横纹肌肉瘤占所有横纹肌肉瘤的12%,占头颈部横纹肌肉瘤的25-35%,发病率在眼眶恶性肿瘤中居第一位。该肿瘤预后差别大,患者预后与多种因素有关。目前在诊断上以常规病理、免疫组化为主要手段。病理诊断上将该肿瘤分为胚胎型（embryonal rhabdomyosarcoma,ERMS）、腺泡型（alveolar rhabdomyosarc-oma,ARMS）和多形型（pleomorphic rhabdomyosarcoma,PRMS）三个亚型。胚胎型最常见,多形型极少见,此两型预后相对。腺泡型较胚胎型少,但是病情凶险,预后差。由于不同的亚型的预后和治疗方式不同,因此,准确的诊断和分型至关重要。但目前常用的常规病理和免疫组化对部分病例的诊断尤其是分型存在困难,需要探索新的手段,分子生物学的进步为该研究提供了可能。本研究旨在探索融合基因PAX3-FKHR、PAX7-FKHR、微小核糖核酸（miRNA）作为病理诊断补充手段的科学性及研究其与预后的关系。横纹肌肉瘤中PAX3-FKHR和PAX7-FKHR产生于染色体t（2;13）、（q35;q14）易位。由生肌转录调控因子PAX3 5′端DNA结合区与另一转录调节因子FKHR 3′端的反式激活区连接形成。PAX3-FKHR、PAX7-FKHR参与细胞多种代谢,影响肿瘤的发生、发展。通过检测上述融合基因的存在,有助于对该肿瘤进行诊断和分型并对预后进行判断。miRNA是一种进化上十分保守的、非编码的单链小RNA家族,长度为18～25个核苷酸碱基,通过调节不同的靶基因的表达,在细胞生理和病理过程中起重要作用。miRNA参与器官产生、组织分化、细胞增殖、脂类代谢、凋亡和肿瘤的发生。文献显示miRNA还可用于肿瘤的分型。到目前为止,未见横纹肌肉瘤中miRNA表达的报道。本研究通过检测miRNA在眼眶横纹肌肉瘤中的表达,探讨其在判断肿瘤预后中应用价值。本研究对2001年1月到2007年9月在武警总医院眼眶病研究所住院手术的29例眼眶横纹肌肉瘤患者临床资料进行分析,对所有病例进行随访。对29例病例的手术标本进行标准HE染色,观察组织病理学特征。针对抗原Vimentin、MyoD1、Myoglobin、actin、Desmin、CD99、Ki-67、P53,对所有标本进行免疫组化染色。10例眼眶非肌源性小细胞恶性肿瘤标本为病例对照组,5例正常眼眶横纹肌标本为正常对照组（来源于眼外肌手术切除的眼外肌标本）。从石蜡包埋肿瘤组织中提取的总RNA为模板,β-actin为内标,进行RT-PCR和半巢式PCR检测PAX3-FKHR和PAX7-FKHR,用DNA测序的方法对PCR产物进行确认。通过包含1320个探针的芯片用来检测miRNA在眼眶横纹肌肉瘤中的表达,对13例标本和5例对照组标本进行检测,使用微阵列差异分析软件进行分析,通过Real time PCR的方法对特异性表达的miRNA进行确认。使用SPSS13.O软件进行统计,生存率比较采用Kaplan-meiler法。29例标本中有19例形态学表现和免疫组化染色结果比较典型,组织病理上诊断为胚胎型横纹肌肉瘤;2例有特征性纤维血管隔,并且形成腺泡样结构,诊断为腺泡型横纹肌肉瘤;8例病变形态学表现不典型,肿瘤细胞分化较差,主要结合免疫组化染色诊断为ORMS,但无法分型。29例标本中有27例成功提取出RNA,其中7例检测到PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表达,表达率为26%。病例对照组和正常人对照组均未检出PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表达,实验组与对照组间差异显著（P<0.01）。病理上未分型的8例中5例PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表达阳性,3例表达阴性。结合文献,5例阳性表达者归为腺泡型,3例阴性者归为胚胎型。通过芯片的检测,发现在肿瘤组织中,hsa-miR-106a、hsa-miR-18b、hsa-miR-92a三种表达显著增高,最高的有11.8倍,hsa-miR-29a、hsa-miR-22、hsa-miR-133b、hsa-miR-133a、hsa-miR-29b、hsa-miR-1、hsa-miR-29c七种表达显著下降。使用Realtime PCR确认hsa-miR-1在肿瘤组织中表达显著下降。结合随访资料,表达下降的程度与病人的预后相关,hsa-miR-1下降越多,预后越差。本研究认为常规病理和免疫组化对大部分典型病例可明确诊断和分型,但对部分肿瘤细胞分化差的病例在诊断上特别是病理分型上有其局限性,PAX3-FKHR/PAX7-FKHR、miRNA-1可作为ORMS分型诊断和判断预后的有效参考指标。另外,与正常眼眶横纹肌组织比较,首次发现ORMS中154个miRNA有差异性表达,其中10个差异性最明显,对进一步研究提供了思路。对其中的hsa-miR-1在ORMS中的表达量进行检测,发现其与肿瘤预后有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 前言
• 第二部分 材料与方法
• 一、临床资料
• 二、仪器与试剂
• 三、实验操作
• 四、统计学分析
• 第三部分 实验结果
• 一、形态学表现、免疫组织化学染色和病理诊断结果
• 二、RT-PCR检测PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的结果
• 三、眼眶横纹肌肉瘤miRNA表达谱的分析结果
• 四、融合基因、miRNA与生存率的关系
• 五、随访结果
• 第四部分 讨论
• 一、HE染色和免疫组化染色在ORMS诊断和分型中的作用与局限性
• 二、PAX3-FKHR、PAX7-FKHR对ORMS分型和预后判断的作用
• 三、miRNA表达量与ORMS预后的关系
• 四、石蜡包埋组织提取RNA影响因素的控制
• 结论
• 参考文献
• 眼眶横纹肌肉瘤诊断研究进展（文献综述）
• 一、横纹肌肉瘤概述
• 二、眼眶横纹肌肉瘤目前的诊断方法
• 三、眼眶横纹肌肉瘤与PAX3-FKHR、PAX7-FKHR融合基因
• 四、miRNA在肿瘤中的表达及应用
• 五、结语
• 参考文献
• 致谢