论文摘要
目的:①采用不同剂量的弓形虫速殖子经腹腔接种孕中期小鼠,建立弓形虫急性感染孕鼠的模型。②利用弓形虫感染孕鼠模型,测定胎盘分泌的生乳素（HPL）、乙酰胆碱（Ach）、表皮生长因子（EGF）的含量,观察虫体是否影响这些激素的水平。③利用弓形虫感染孕鼠模型,测胎盘胰岛素生长因子-II（IGF- II）的含量和11β-羟基类固醇脱氢酶-2（11 -HSD2）的表达,观察虫体是否影响胎儿的生长发育。④利用弓形虫感染孕鼠模型,测胎盘分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）和一氧化氮合酶（eNOS和iNOS）的含量,观察虫体是否影响胎盘血流。通过以上实验指标的观察,探讨弓形虫感染宿主孕鼠,是否影响胎盘激素正常的调节功能,来系统地分析和揭示弓形虫感染妊娠期宿主影响胎盘内分泌的作用机制。方法:1.建立弓形虫感染孕中期的小鼠模型:取约10周龄健康的BALB/C处女鼠,体重（20～22g）,与雄鼠2:1合笼,次晨查阴栓,查到阴栓记为妊娠第0天,并称孕鼠体重。于妊娠第8天再称孕鼠体重,体重增重大于1.5g者纳入实验鼠。将检出的100只孕鼠,随机分为5组（A-E组）,每组20只。A组为正常对照组, B、C、D、E组为染虫组,A组孕鼠经腹腔注射0.2ml无菌PBS,B-E组孕鼠腹腔分别注射经胰酶蛋白酶消化的弓形虫速殖子25、50、100、200个/0.2ml/只。①观察各组孕鼠的健康状态,有无竖毛、倦怠、弓背等异常表现,体重增加情况。②确认孕鼠是否染虫于妊娠第12d、14d、16d、18d称重、随机、分批处死各组孕鼠5只,抽取腹腔液中查找弓形虫速殖子。③各剂量组孕鼠处死,取胎鼠和胎盘,解剖镜下观察胎鼠的存活,有无吸收胎及死胎数,计算胎鼠的存活率。④称胎盘的重量。通过以上指标观察各剂量虫体对孕鼠的毒性作用,建立弓形虫急性感染孕中期的小鼠模型。2.将检出的孕鼠40只,随机分为2组（正常对照组和染虫组）,每组20只;孕鼠于妊娠第8天,正常对照组腹腔注射0.2ml无菌PBS,染虫组腹腔注射50个/0.2ml/只,于妊娠第12d、14d、16d、18d处死孕鼠,收集母鼠血清,备用;将各组1/2的胎盘制成匀浆液,采用放射免疫分析法（radioimmunoassay,RIA）检测生乳素（HPL）的含量,碱性羟胺比色法测乙酰胆碱（Ach）的含量;剩余1/2胎盘固定、包埋、切片,用免疫组织化学法（immunohistochemistry）测胎盘组织表皮生长因子（EGF）的表达量。通过以上三个指标分析和阐述虫体对胎盘激素致物质转运的影响;3.用酶联免疫吸附试验（ELISA）测胎盘匀浆液中IGF-Ⅱ含量,采用免疫组化法测胎盘组织内11β-HSD2的表达量,分析弓形虫对胎盘激素致胎儿发育不良的影响; 4.利用收集各组孕鼠的血清,用ELISA测母体血清中促肾上腺激素释放激素（CRH）的含量,用免疫组化法测胎盘组织中eNOS和iNOS的表达,分析虫体对胎盘激素致胎盘血流的影响。结果:①正常对照A组孕鼠随着妊娠天数的增加,孕鼠未见竖毛、倦怠、弓背等异常表现,体重增加明显,胎鼠发育外观正常,存活率高达97%;。染虫组孕鼠随着妊娠天数的延长,孕鼠有不同程度呈现竖毛、倦怠、弓背、活动量和采食量减少等异常表现;除了B组,染虫孕鼠体重均不同程度呈现先增后降的趋势。B组和C组随着妊娠天数的延长,各个妊娠天数均有活胎存在,但其存活率低于A组;而D和E组在妊娠后期无存活胎鼠,说明D、E剂量对胎鼠及胎盘的毒性作用较大,不宜作为建模的实验剂量;将B组和A组、C组和A组相同妊娠天数胎鼠存活率进行比较,结果显示:B组与A组仅在妊娠第18d,差异有统计学意义（P<0.05）;C组与A组除了妊娠第12d,其余妊娠天数差异均有统计学意义（P<0.05）。对胎盘重量进行均数比较,组内不同妊娠天数,差异均有统计学意义（FA=53.731,FB= 16.319,FC=7.621,FD= 11.336,FE=3.367,P<0.05）;组间相同妊娠天数,B-E组胎盘重量均低于正常对照组,B组与A组比较,仅在妊娠第16d差异有统计学意义（P<0.05）,C组和A组比较,除了妊娠第12d,差异均有统计学意义（P<0.05）。②弓形虫感染孕中期小鼠,正常对照组胎盘组织中生乳素的含量随妊娠天数的增加而增多,而染虫组则先升高后下降;乙酰胆碱和表皮生长因子的含量随着妊娠天数的增加而下降,但染虫组的含量下降较为明显。两组内不同妊娠天数的比较,胎盘组织中生乳素和表皮生长因子的含量差异有统计学意义（HPL:F正常对照组=3.260, F染虫组=5.573;EGF:F正常对照组=6.343,F染虫组=23.366,P<0.05）;正常A组乙酰胆碱含量差异无统计学意义（F正常对照组=3.091,P=0.57）,染虫组差异有统计学意义（F虫染组=20.933,P=0.00）;两组间均数比较,生乳素和乙酰胆碱含量在妊娠第16天和第18天的差异有统计学意义（P<0.05）,表皮生长因子的表达量在妊娠第14天、16天、18天差异有统计学意义（P<0.05）。③IGF–II检测结果显示:正常对照组胎盘组织随着妊娠天数的延长,其含量基本呈逐渐上升的趋势,但是染虫组则先降低后升高,波动更加明显。两组内不同妊娠天数比较,差异有统计学意义（F正常对照组= 11.763,F染虫组=39.137,P<0.05）;两组间相同妊娠天数比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。11 -HSD2检测结果显示:正常对照组的表达呈现出逐渐升高的趋势,但是感染组升高的趋势不及正常对照组明显,不同妊娠天数比较,正常对照组差异均有统计学意义（F正常对照组= 4.319,P=0.021）,而染虫组差异无统计学意义（F染虫组=0.313,P=0.816 ）;相同天数比较,除了第12天外,其余天数差异均有统计学意义（t12d=2.066,P=0.242 ;t14d=3.264,P=0.011;t16d=2.625,P=0.030;t18d=3.274,P=0.011）。④免疫组化定位显示,eNOS主要表达于胎盘合体滋养层细胞和血管内皮细胞中,iNOS表达在胎盘巨噬细胞中。在正常对照组:eNOS的表达水平无明显变化,而iNOS的表达水平极低;两者表达水平染虫组均高于正常对照组。经两组不同妊娠天数比较,正常对照组差异无统计学意义（eNOS:F正常对照组=2.390,P=0.107;iNOS: F正常对照组=0.816,P=0.504）,染虫组差异有统计学意义（eNOS :F染虫组=11.398,P<0.05;iNOS: F染虫组=610.230,P=0.000）;相同妊娠天数比较,eNOS的表达量分别于妊娠第16d和18d差异有统计学意义（P<0.05）,而iNOS表达量于12d、14d、16d、18d均有统计学意义（P<0.05）。ELASE测定血清中CRH的含量,正常对照组于妊娠16天浓度开始升高（0.60 0.18）ng/ml;染虫组于妊娠14d明显升高（0.160.89）ng/ml,16d达高峰（6.30 1.24）ng/ml,而妊娠18天下降为初始水平。两组不同妊娠天数比较,差异均有统计学意义（F正常对照组=31.48,F染虫组=20.154,P<0.05）;两组间相同妊娠天数比较,除第12d,其余各妊娠天数差异均有统计学意义（t12d=0.763, P=0.467;t14d= 2.56, P=0.018;t16d=9.580, P=0.000; t18d=3.878, P<0.05）。结论:①采用50个弓形虫速殖子腹腔接种,其生殖毒性反应小,胎鼠存活率高,是弓形虫感染孕中期小鼠的适宜剂量。②弓形虫感染孕中期小鼠,引起胎盘组织中HPL、Ach和EGF含量水平降低,说明胎盘对葡萄糖、氨基酸等物质的转运减弱,影响了胎儿营养供给不足,可能导致胎儿发育不良。③弓形虫感染孕中期小鼠,造成胎盘IGF-II含量及11β-HSD2表达降低,而影响胎盘血管形成及糖原合成与转运、破坏糖皮质激素屏障,导致胎盘缺血缺氧、胎儿发育迟缓。④弓形虫感染孕鼠,胎盘eNOS、iNOS水平升高,产生过多NO,使胎盘细胞受损,血管阻力增高;而胎盘分泌CRH早期可为胎儿缺血缺氧提供生理性保护和晚期则失代偿。这些激素水平变化可使胎盘血流不足,胎儿缺血缺氧,影响胎儿的生长发育。
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- [2].桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响[J]. 中国兽医杂志 2011(11)
- [3].对弓形虫感染孕鼠出生子鼠干预效果、免疫功能研究[J]. 现代预防医学 2010(06)