MicroRNA-128在神经胶质瘤中的生物学功能研究

论文摘要

MiRNAs是一类内源性的非编码RNA,可以通过结合到靶基因的3’非编码区、5’非编码区或者蛋白编码区来促进或抑制靶基因的表达,其中目前研究最多的调控方式是它以不完全互补的形式结合到目的基因的3’非编码区,来抑制靶基因的表达。MiRNA的功能涉及到各个生理和病理过程中,在人类最常见的脑肿瘤之一——神经胶质瘤的发生发展中也可能起着举足轻重的作用。在本研究中,我们首先选取了9例胶质瘤样本组织（包括Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级各3例）,4株神经胶质瘤细胞系（T98G、U87、U251、A172）和2例正常脑组织,用real-timePCR的方法检测了miR-128在其中的表达差异。结果发现,其在胶质瘤组织和细胞系中的表达都明显低于正常脑组织,而且其表达和病理分级相关,病理分级越高,miR-128表达越低。将miR-128的成熟序列转染神经胶质瘤T98G细胞后,MTT实验和BrdU掺入实验检测到活细胞数减少、增殖减缓,但用hochest染色法没有观察到有细胞凋亡的现象。因此,miR-128可能影响到与细胞增殖有关的某个或某些基因的表达,但可能不涉及细胞的凋亡。进一步结合生物信息学的预测,我们寻找了相关的8个与细胞增殖或者神经分化相关的基因作为预选靶基因,包括E2F3a、BMI-1、SOX11等,将它们含有miR-128结合位点的序列克隆到荧光素酶报告基因的下游,发现miR-128可以与E2F3a 3’UTR区的靶位点结合并抑制其所在报告基因的表达。将miR-128转入T98G细胞,Western Blot实验检测到miR-128可以减少内源性E2F3a的蛋白水平,但不影响其mRNA水平。说明E2F3a可能是miR-128在神经胶质瘤中的一个靶基因。E2F3a是一个细胞从G1期到S期的调控因子,E2F3a的高表达能促进细胞的增殖,相反则抑制细胞的增殖。我们同样选取了9例胶质瘤样本组织（包括Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级各3例）和2例正常脑组织,从Western Blot实验和免疫组化实验中都发现E2F3a的表达在神经胶质瘤组织中要明显高于正常脑组织,与miR-128的表达呈负相关。合成E2F3a的siRNA序列,抑制其表达后可以引起与增加miR-128类似的效应;而在增加miR-128的同时过表达E2F3a又可以部分的挽救由miR128引起的增殖抑制。进一步说明miR-128可能影响到神经胶质瘤中E2F3a的表达。同时表明在神经胶质瘤中miR-128还调控除E2F3a外的其它基因的表达。为了进一步全景式分析miR-128在神经胶质瘤中调控的靶基因,我们采用pSILAC蛋白质组学技术,鉴定miR-128在胶质瘤中调控的靶基因。质谱结果共检测到1700多个蛋白,其中表达增加0.5倍以上只检测到4个,表达降低50%以上的检测到57个,主要与细胞的代谢、增殖等有关。根据经典的miRNA靶位点预测方式,在这57个基因中TROVE2、CCNK等7个基因的mRNA 3’UTR区具有miR-128的结合位点,它们可能为miR-128的直接靶基因。而其它基因可能与miR-128具有另外的结合方式或为间接作用蛋白。从上述实验可以看出,miR-128在神经胶质瘤细胞、组织中低表达,它通过抑制胶质瘤中与增殖等有关基因的表达而抑制胶质瘤的增殖。细胞周期相关因子E2F3a是它其中的一个靶基因。此外,miR-128在神经胶质瘤中还抑制了包括在TROVE2、CCNK等多个基因的表达,其更多的功能机制还有待进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 不足和展望
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 个人简历
• 致谢