论文摘要
目的与背景宫颈癌是一种最常见的妇科恶性肿瘤，在妇女癌症相关死亡原因中居第二位。近年来，随着性传播疾病的发病率逐年增加，宫颈癌的发病率有上升和年轻化趋势。hWAPL基因是一个近年来发现的宫颈癌特异性高表达基因，具有癌基因特性。hWAPL基因是果蝇WAPL基因在人体内的同源序列，长约30 793bp，定位于10q23.2，编码一种聚合锚定蛋白，可以在有丝分裂前期使染色体臂的聚合适时解离。其具体作用机制尚不甚明确，但其过度表达，则会使得姐妹染色单体过早解离。目前关于hWAPL基因在我国妇女宫颈癌组织中的表达情况尚未见报道，本课题研究hWAPL基因在中国妇女宫颈癌组织中的表达情况并探讨其与宫颈癌发生发展的关系及其意义。第一部分hWAPL基因蛋白表达水平检测材料与方法应用免疫组织化学PV-9000对413例存档石蜡切片进行检测。其中正常宫颈组织27例，宫颈癌47例，宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ30例，CINⅡ33例，CINⅢ38例，胃癌29例，肝癌28例，膀胱癌26例，食管癌35例，子宫内膜癌25例，肾癌26例，直肠癌36例，肺癌33例。采用显色强度结合阳性细胞百分比法判读结果。以细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，计3分；出现黄色颗粒，计2分；出显淡黄色颗粒或无黄色颗粒出现，分别计1分或0分。阳性细胞率6％～25％计1分，26％～50％计2分，51％～75％计3分，≥76％为4分。以染色强度分值与阳性细胞率分值的乘积作为最后得分，以积分≥3分为阳性表达病例。实验数据采用SPSS10.0统计软件进行分析。各组免疫积分之间利用单因素方差分析，各组阳性率之间利用x2检验，检验水准α=0.05。结果正常宫颈组织仅在其基底部上皮细胞胞浆中偶可见少量淡黄色颗粒。随着宫颈病变程度的加重，细胞染色强度逐渐加深，阳性染色细胞比例逐渐增加。宫颈癌组上皮全层细胞胞浆中均可见黄色或棕黄色颗粒。hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌、肺癌中组织细胞胞浆中无黄色颗粒或偶见散在淡黄色颗粒；在膀胱癌和食管癌组织中，仅有部分样本细胞胞浆中可见淡黄色颗粒。hWAPL基因在宫颈癌组中免疫积分（x±s，6.49±2.54）显著高于CINⅢ组（4.89±1.67），P＜0.001。CINⅢ组免疫积分显著高于CINⅠ组（2.45±1.06）和CINⅡ（2.20±1.19）组，P均小于0.001。CINⅠ组和CINⅡ组免疫积分差异不显著，P=0.553。CINⅠ组免疫积分显著高于正常宫颈组（0.52±0.70），P＜0.001。正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的hWAPL基因阳性表达率亦逐渐升高，分别为3.70％、40.00％、42.42％、89.47％和97.87％。宫颈癌和正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ组阳性表达率差异显著（x2=87.531，p＜0.001）。hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌、肺癌中呈阴性表达；在膀胱癌和食管癌中，仅有部分样本呈阳性表达，阳性表达率分为11.54％和14.28％；在宫颈癌阳性表达率则高达97.87％。第二部分hWAPL基因mRNA表达量的分析材料与方法采用实时定量PCR技术检测8例正常宫颈和11例宫颈癌新鲜组织中的mRNA表达情况。以β-actin基因为内参。β-actin引物序列为5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’和5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3’。HWAPL基因引物为5’AATTGTCGAGCACTGATAGAG3’和5’TTAAGTCAGCCTCAAGTACCC3’。反应条件为94℃，2min，预变性；94℃，30s，变性；58℃，30s，复性；72℃，40s，延伸；共进行35个循环。每个样品做两个平行，并设有两个空白对照。反应完成后，PCR扩增仪电脑自动绘制标准曲线，得到样本所有记录点曲线，给出Ct值、扩增曲线和目的基因拷贝数。样本hWAPL基因mRNA拷贝数/内参β-action基因mRNA拷贝数=hWAPL基因mRNA相对定量。实验数据采用SPSS10.0统计软件进行分析。两组间hWAPL基因相对表达量比较利用t检验，检验水准α=0.05。结果正常宫颈组hWAPL基因相对表达量为1.81±0.58（x±s），宫颈癌组hWAPL基因相对表达量为11.16±1.097。两组间hWAPL基因mRNA表达量存在显著差异（T=21.838，P＜0.001）。结论hWAPL基因是宫颈癌特异性高表达基因；随着宫颈上皮内瘤变程度的加深，hWAPL基因表达量增高；宫颈癌组织中hWAPL基因mRNA呈显著高表达。