论文摘要
研究背景与目的肠黏膜屏障是机体最重要的免疫防御屏障之一,它将机体与肠道内的外源性物质隔离开来,避免病原微生物侵袭和抗原分子的损伤。肠黏膜屏障包括肠上皮细胞屏障、免疫屏障和微生物屏障,而肠上皮细胞屏障是其最重要的一道屏障,是肠黏膜屏障具有选择性通透的基础。目前研究发现肠上皮细胞屏障通透性增高参与多种疾病的发生（如炎症性肠病、败血症、烧伤等）,并且在这些情况下,血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）明显升高,与肠上皮细胞屏障的损害程度呈正相关,抗TNF-α抗体可以恢复受损的肠上皮细胞屏障。因此认为TNF-α是增加肠上皮细胞屏障通透性的重要因素。虽然目前已经形成共识TNF-α可以增加肠上皮细胞屏障的通透性,但其具体作用机制和方式还存在争议。早期认为与TNF-α引起的细胞凋亡密切相关,近年来则倾向于TNF-α引起肠上皮细胞屏障损伤是凋亡非依赖性的。另外TNF-α引起肠上皮细胞屏障通透性增高的具体调控环节也不十分清楚,它可能与蛋白激酶C（PKC）、核因子一κB（NF-κB）.肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）等信号途径有关。因此本研究利用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型,观察TNF-α对其通透性的影响,并探讨TNF-α导致肠上皮细胞屏障通透增加的可能机制。研究方法1体外肠上皮细胞屏障模型的建立应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型,应用跨上皮细胞电阻（transepithelial electrical resistance,TEER）指标检测肠上皮细胞屏障的形成情况。2质粒转染及分组待Caco-2细胞成紧密单层后无血清培养24h,根据有无转染NF-K B抑制质粒（Mu-IκB）将其分为Mu-IκB质粒转染组（M-TNF-α组）和Mu-IκB质粒未转染组（TNF-α组）。进一步根据TNF-α组预处理时间,两组分别分为M-TNF-α0、3、6、12、24h；TNF-α0、3、6、12、24h 5个亚组,各亚组于其相应的时间点在Transwell基底侧加入100μg/L TNF-α分别孵育0、3、6、12、24h,其中Oh亚组未予TNF-α刺激。3 TNF-α对肠上皮细胞屏障通透性的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间（0、3、6、12、24h）,观察各组Caco-2细胞屏障TEER的改变。4 TNF-α对肠上皮细胞NF-κB活性的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间（0、3、6、12、24h）,采用荧光素酶报告基因检测Caco-2细胞NF-κB活性。5 TNF-α对肠上皮细胞肌球蛋白轻链（myosin light chain,MLC）磷酸化的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间（0、3、6、12、24h）,采用蛋白质印迹法（western blot）检测MLC磷酸化蛋白的表达水平6 TNF-α对肠上皮细胞F-actin的影响加入100μg/L TNF-α作用不同时间（0、3、6、12、24h）,罗丹明-鬼笔环肽直接染色免疫荧光显微镜下观察Caco-2细胞间F-actin改变。研究结果1 TNF-α致肠上皮细胞的通透性变化TNF-α引起Caco-2细胞TEER降低,并具有时间依赖性。TNF-α作用3h后,TEER值下降,与TNF-α0h组比较差异有显著性降低（P<0.05）,TNF-α作用24h,TEER降至最低,是TNF-α0h组的68.7%。抑制NF-κB的活性（转染Mu-IκB质粒）后,TNF-α引起Caco-2细胞TEER降低,M-TNF-α各亚组与TNF-α相应各亚组相比,其TEER降幅均有显著减少（P<0.05）。2 TNF-α致肠上皮细胞NF-κB的活性变化TNF-α3h、6h、12h组NF-κB活性增高,与TNF-α0h组比较有显著性差异（均P<0.05）,其中TNF-α12h亚组NF-κB活性最高,与TNF-α0h、3h、6h、24h亚组比较有显著性差异（均P<0.05）。转染Mu-IκB质粒后TNF-α作用3h时NF-κB活性开始增高,与M-TNF-α0h组比较有显著性差异（P<0.05）,随作用时间延长,NF-κB活性进一步增高,12h达到最高,随后NF-κB活性下降。M-TNF-α各亚组与TNF-α相应各亚组相比,其NF-κB活性增高幅度均有显著性降低（P<0.05）。3 TNF-α致肠上皮细胞MLC磷酸化水平变化与TNF-αOh组比较,TNF-α作用6h,MLC磷酸化水平增加,转入Mu=IκB质粒后,TNF-α作用6h,MLC磷酸化水平无明显改变,作用12h才出现MLC磷酸化增加。显示降低NF-κB活性后TNF-α引起MLC磷酸化作用延迟。4 TNF-α致肠上皮细胞间F-actin变化正常CaCo-2细胞,紧密连接结构完整,呈致密的带状结构。加入100μg/L TNF-α作用12h细胞外周致密带边缘变得毛糙不规整,细胞荧光染色减弱,作用24h细胞外周轮廓模糊难辨,逐渐出现锯齿样断裂,趋于变细崩解消散。转染Mu-IκB质粒后,M-TNF-α3、6、12h组Caco-2细胞的F-actin无明显改变,M-TNF-α24h组细胞外周致密带边缘开始变得毛糙不规整,细胞荧光染色减弱。研究结论肠上皮细胞MLC磷酸化及F-actin重组是TNF-α致其通透性增高的机制之一,此过程可能受NF-κB的调控。
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