一株海洋细菌的初步鉴定和相关功能基因（簇）的克隆

论文摘要

本研究对分离自近海沼泽地大米草根际一株细菌进行了形态观察、生理生化分析以及16S rDNA的克隆和序列分析，初步鉴定其分类地位归为海洋单胞菌属（Marinomonas）。该菌革兰氏染色呈阴性，直杆状；基于16S rDNA序列的Blast分析表明，该菌与Marinomonas pontica和Marinomonas dokdonensis的序列相似值分别为97％和95％。其准确种属分类地位有待于进一步深入的相关实验研究和鉴定。该分离菌株MWYL1除能够降解DMSP（DMSP即是二甲基亚砜丙酸盐，一种渗透保护物，主要存在于海洋中，由海洋中的一些浮游植物、藻类、蓝细菌和海岸植物等产生。它能被细菌降解产生气态二甲基硫化物（DMS），进而从海洋释放到大气中，因此在驱动海洋和大气之间的硫素循环中具有重要作用）外，还能够以硝酸盐、亚硝酸盐为惟一氮源进行生长，可能参与硝酸盐同化还原（由nas基因控制）或有氧反硝化作用（由硝酸盐还原酶基因nap、亚硝酸还原酶基因nir控制）。为克隆和研究其相关功能新基因，进而进一步阐明其代谢途径，本研究构建了该菌株的基因组fosmid文库。其基因组DNA的制备和纯化采用QIAGEN Genomic-tip 100／G试剂盒完成，文库的构建采用Copy Control Fosmid Library Production Kit进行，外源插入片段平均在35-40 kb，文库初始大小约含1.5-2.0 X 106克隆。并且，偶然筛选到能够产生黑色素的阳性克隆，经亚克隆得到约14kb的外源插入片段，对全序列进行了测序，并且对功能片段做生物信息学分析。但是，利用硝酸盐作为惟一氮源的克隆未能直接筛选到。由于不能从文库直接筛选到利用硝酸盐的阳性克隆，因此，通过Tn5插入突变构建了随机插入突变库，采用E. coli S17-1（pUT-miniTn5 Tc）与海洋单胞菌利福平自发突变株双亲本接合转移，分离到了不能利用硝酸盐的突变株8株，采用Genomic walking PCR（Tail—PCR，热不对称交错PCR）的方法分析了Tn5插入旁侧序列。并且，该体系的初步建立也将为深入开展其功能基因组学奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 海洋单胞菌简介
• 1.1 海洋单胞菌属的分类地位
• 1.2 海洋单胞菌生态分布
• 1.3 新酶和功能蛋白质的研究
• 2 黑色素的研究现状
• 2.1 黑色素的分类
• 2.2 黑色素的共性特征
• 2.3 黑色素生物合成途径中的关键酶
• 2.4 黑色素在细胞中的定位
• 2.5 黑色素在细菌中扮演的角色
• 2.5.1 黑色素在异化细菌中作为电子受体
• 2.5.2 黑色素在细菌介导的大气氮的固定中的作用
• 2.5.3 黑色素在病原细菌中作为毒力因子
• 2.6 细菌黑色素的分子遗传
• 2.7 黑色素的应用领域
• 2.7.1 黑色素在工业上的应用
• 2.7.2 黑色素在农业上的应用
• 2.7.3 黑色素在食品业上的应用
• 2.7.4 黑色素在医药上的应用
• 2.7.5 黑色素在环境保护上的应用
• 3 转座子插入突变
• 3.1 转座子的插入机制和随机诱变作用
• 3.2 利用转座子插入诱变分离目的基因
• 3.3 转座子插入位点旁侧序列分析的常用方法
• 3.4 转座子插入突变在微生物功能基因组学中的应用
• 4 展望
• 本研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与培养条件
• 2.1.3 常用溶液、缓冲液配制
• 2.1.4 工具酶、试剂盒及引物合成
• 2.1.5 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株的初步鉴定
• 2.2.2 黑色素生物合成相关基因（簇）的克隆及序列分析
• 2.3 海洋单胞菌MWYL1丧失硝酸盐利用突变株的筛选
• 2.3.1 MWYL1自发突变株的筛选
• 2.3.2 转座子插入突变库的建立及丧失硝酸盐利用突变株的筛选
• 2.3.3 Mini-Tn5转座子插入到MWYL1基因组中验证
• 2.3.4 转座子插入位点的定位分析
• 2.3.5 测序结果序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 细菌的初步鉴定结果
• 3.1.1 菌落形态观察及革兰氏染色
• 3.1.2 生理生化实验
• 3.1.3 盐耐受试验
• 3.1.4 菌株MWYL1生长的pH值范围
• 3.1.5 抗生素敏感性实验结果
• 3.1.6 PCR扩增结果
• 3.1.7 16S rRNA基因序列的BLAST分析
• 3.1.8 系统发育分析
• 3.1.9 小结
• 3.2 黑色素生物合成基因簇的分离及生物信息学初步分析
• 3.2.1 菌株MWYL1的基因组DNA纯度及酶切
• 3.2.3 基因组文库构建质量检测与文库保存
• 3.2.4 产生黑色素克隆的发现及亚克隆
• 3.2.5 序列分析
• 3.2.6 推测主要基因编码蛋白的预测及分析
• 3.2.7 推定基因在相关黑色素合成中的功能
• 3.3 海洋单胞菌MWYL1丧失硝酸盐突变株的筛选
• 3.3.1 海洋单胞菌MWYL1自发突变株的筛选
• 3.3.2 不能利用硝酸盐突变株的筛选
• 3.3.3 突变株中mini-Tn5转座子插入基因组的检测
• 3.3.4 不能利用硝酸盐突变株转座子插入位点分析
• 3.3.5 小结与讨论
• 4 讨论
• 5 进一步研究设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录