DNA修复基因XRCC1和MGMT单核苷酸多态性与宫颈癌易感性的关系

论文摘要

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。目前已经确定，高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）感染是宫颈癌的发生的必要因素。大量以人群为基础的流行病学资料显示，在99％以上的宫颈癌组织中存在HR-HPV DNA。已经发现，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）基因组有110多种型别，其中感染人生殖道的有50余种，根据对生殖系统的致瘤性的不同分为低危型和高危型两大类。在HR-HPV感染宿主细胞的致癌过程中，病毒DNA和宿主DNA整合是HR-HPV致癌的关键。HR-HPV DNA整合到宿主DNA后，病毒E6、E7基因表达，导致宿主细胞转化与增殖。另一个与宫颈癌关系密切的环境因素是行为危险因素，其中最重要的是性行为因素，如首次性生活年龄、性伴侣个数等。另外，多产、早育可能造成宫颈裂伤而增加宫颈癌的风险。口服避孕药、吸烟、社会经济条件和受教育程度等也被认为与宫颈癌的风险增加有关。然而，无论上述任何一种环境致瘤因素，都无法解释同一个问题，那就是：即使处在完全相同的环境致瘤因素的暴露下，发生宫颈癌与否依然存在非常显著的个体差异。流行病学资料显示，在人群中HR-HPV感染可高达15％～40％，而宫颈癌发病率仅15／10万左右，提示大部分HR-HPV感染并未造成宫颈癌的发生。宫颈癌的发生是环境致瘤因素与机体内在因素共同作用的结果。目前认为，遗传背景是最重要的机体内在因素之一。与疾病相关的遗传背景又称遗传易感性。疾病遗传易感性是由个体基因组上的单个核苷酸决定的。人类基因组中单个核苷酸的不同称为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）。SNP是在人类长期进化过程中，由于环境的选择而形成的，表现为在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。对宫颈癌遗传背景的研究始于HLA的基因多态性。已有报道，宫颈癌的发生与p53基因72号密码子多态性有关，当该密码子编码精氨酸时，比编码脯氨酸更易被HR-HPV E6降解，个体发生宫颈癌的几率高7倍。自此，癌基因与抑癌基因、免疫相关基因及代谢解毒基因的多态性也相继进入研究领域，并取得了相应的成果。然而，目前宫颈癌SNP研究所涉及的基因，大多是与肿瘤发生直接相关的癌基因或抑癌基因，而很少有文献关注到其上游的、潜在影响遗传背景的“护理基因”（caretaker），如：DNA修复基因。DNA修复基因与肿瘤的发生密切相关，对于DNA复制的忠实性和基因组的稳定性起着重要作用。DNA修复基因的多态性可改变修复酶的结构和活性并影响其肿瘤易感性。人类X射线交错互补修复基因1（X-ray repair cross complementing gene 1，XRCC1）广泛参与DNA损伤的修复，是目前研究较多的一种DNA修复基因，研究显示它的表达异常和多种恶性肿瘤的发生有关。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine DNA methyhransferase，MGMT）是另一种普遍存在的高效DNA直接修复酶。业已证明，XRCC1基因的保守序列区有3个SNP位点，分别是Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln，可导致其蛋白质相应氨基酸的改变。MGMT基因也存在3个导致氨基酸改变的SNP位点，分别是Leu84Phe、Ile143Val和Lys178Arg。目前认为，XRCC1与MGMT基因SNP可能与恶性肿瘤的发生有关。迄今为止，关于XRCC1和MGMT基因SNP与宫颈癌易感性的报道极少。本课题选择两个DNA修复基因XRCC1和MGMT为宫颈癌遗传背景研究的切入点，首先以测序法为金标准，比较限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和错配扩增聚合酶链式反应（mismatch amplification polymerase chain reaction，MAMA-PCR）两种方法检测SNP的准确度、敏感度、特异度等，选择MAMA-PCR为本课题的研究方法；在此基础上，通过病例对照研究，检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤样变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和对照组的XRCC1和MGMT基因SNP，并分析其与宫颈癌、CIN易感性之间的关系；最后，采用多因素分析方法，探讨XRCC1和MGMT基因SNP在增加宫颈癌易感性中与HR-HPV感染及其他行为危险因素的关系，旨在阐明DNA修复基因SNP在宫颈癌发生中的作用，为宫颈癌的防治提供新的思路。第一部分两种SNP检测方法的比较研究目的选择一种准确、简便、实用、可用于较大规模SNP研究的检测方法。材料和方法选择2004年10月～2005年3月在浙江大学医学院附属妇产科医院做常规妇科检查的健康妇女共200例，首先随机选择50例用MAMA-PCR和RFLP方法检测XRCC1基因上的2个SNP位点Arg194Trp和Arg399Gln的SNP型别，并以测序法为金标准分别比较其准确度、敏感度、特异度等。在此基础上，选择MAMA-PCR法对200例健康妇女检测XRCC1基因上的2个SNP位点。结果1．用自行设计的MAMA-PCR引物均能对各SNP位点的两个等位基因进行明确区分。纯合子分别在不同的泳道出现1条单一条带，杂合子在两条泳道均出现条带。用MAMA-PCR方法对两个SNP位点的50例检测结果与测序结果完全一致，准确度、敏感度、特异度均为100％。2．用RFLP方法测定，对于XRCC1 Arg194Trp位点，Arg194Arg（CC）纯合子只产生1个DNA片段485bp，XRCC1 Trp194Trp（TT）纯合子产生2个DNA片段（396bp和89bp），Arg194Trp（CT）杂合子则产生3个片段（485、396、89bp）。对于XRCC1 Arg399Gln位点，Arg399Arg（GG）纯合子产生2个DNA片段（384bp和133bp），Arg399Gln（GA）杂合予只有1个DNA片段（517bp），Gln399Gln（AA）纯合子则产生3个片段（517、384、133bp）。用RFLP对两个SNP位点的50例检测结果也与测序结果完全一致，准确度、敏感度、特异度也均为100％。3．用MAMA-PCR方法检测200例健康女性XRCC1Arg194Trp和XRCC1Arg399Gln基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，且等位基因频率与以往报道均一致。结论MAMA-PCR技术是一种准确、简便、实用的SNP分型方法，适用于较大规模的SNP检测。第二部分XRCC1和MGMT基因SNP和宫颈癌易感性的关系研究目的揭示XRCC1和MGMT基因SNP与宫颈癌易感性的关系，为宫颈癌的预防和治疗提供新的思路。材料和方法选择2004年3月～2006年5月在浙江大学医学院附属妇产科医院等五所医院就诊并经病理学确诊的539例宫颈癌患者和473例CIN患者，及同期在浙江大学医学院附属妇产科医院做常规妇科检查的健康女性800例，采用MAMA-PCR的方法测定XRCC1 Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln和MGMT Leu84Phe、Ile143Val、Lys178Arg的SNP型别。结果1．t检验和卡方检验均显示宫颈癌、CIN和正常对照人群在年龄分布无显著性差异，具有可比性。2。对于XRCC1 Arg399Gln和Arg194Trp位点，三组间的等位基因频率和基因型分布都存在显著性差异。然而，XRCC1 Arg280His位点和MGMT三个SNP的等位基因频率和基因型分布在宫颈癌组、CIN组和对照组都没有显著性差异。3．Logistic回归分析显示，相对于野生型纯合子XRCC1 Arg399Arg（GG）的女性，变异型纯合子Gln399Gln（AA）的女性罹忠宫颈癌的风险增加2.32-倍[95％CI（1.47-3.65）]，而杂合子Arg399Gln（GA）也同样增加宫颈癌的风险[OR 1.58（95％CI 1.24-2.00）]，携带至少1个Gln的个体（GA／AA）增加68％的宫颈癌风险[（OR=1.68；95％CI 1.34-2.10）]。和XRCC1 Arg194Arg（CC）野生型纯合子比较，变异型纯合子Trp194Trp（TT）和携带至少1个Trp的个体CT／TT都显著增加宫颈癌的风险[ORs和95％CIs分别为2.09（1.45-3.02）和1.28（1.03-1.59）]。而Arg280His既不增加也不减少宫颈癌的风险。对于MGMT基因，相对于野生型纯合子Lys178Lys（AA）的女性，变异型纯合子Arg178Arg（GG）的女性罹患宫颈癌的风险增加2.49倍[95％CI（1.02-6.0）]，而杂合子Lys178Arg（GA）并不增加宫颈癌的风险。对于另外一个位点Ile143Val，和Ile143Ile（AA）野生型纯合子比较，变异型纯合子Val143Val（GG）显著增加宫颈癌的风险[ORs和95％Cls为2.47（1.01-6.01），而杂合子Ile143Val（GA）并不增加宫颈癌的风险。Leu84Phe既不增加也不减少宫颈癌的风险。4．鳞癌组的结果和以上所有宫颈癌组（共539例，含鳞癌、腺癌、腺鳞癌、未分化癌和癌肉瘤）非常相似。在腺癌组和其他类型的宫颈癌中，没有类似发现。在CIN组也没有类似的结果出现。5．采用在正常人群中最常见的XRCC1单体型194Arg（C）-280Arg（G）-399Arg（G）作为参照，其他3种单体型194Trp（T）-280Arg（G）-399Arg（G）、194Arg（C）-280His（A）-399Arg（G）和194Arg（C）-280Arg（G）-399Gln（T）均显著增加宫颈癌的风险[OR和95％CI分别为1.98（1.62-2.40）、1.85（1.41-2.41）和2.30（1.86-2.85）]。采用在正常人群中最常见的MGMT单体型84Leu（C）-143Ile（A）-178Lys（A）作为参照，带有84Phe（T）-143Val（G）-178Arg（G）单体型的个体显著增加宫颈癌的风险近2倍[OR和95％CI为1.88（1.08-3.29）]。而另外3种单倍体均不增加宫颈癌的风险。鳞癌组的结果和以上所有宫颈癌组（共539例，含鳞癌、腺癌、腺鳞癌、未分化癌和癌肉瘤）非常相似。在腺癌组和其他类型的宫颈癌中，没有类似发现。结论XRCC1Arg399Gln、Arg194Trp和MGMT Lys178Arg、Ile143Val的SNP基因型和单体型均增加宫颈癌的风险。第三部分XRCC1和MGMT基因SNP、HR-HPV感染及行为危险因素对宫颈癌易感性的多因素分析研究目的揭示XRCC1和MGMT基因SNP在增加宫颈癌易感性中与HR-HPV感染及其他行为危险因素的关系。材料和方法病例组和对照组的收集同第二部分。采用以医院为基础的病例对照研究方法，问卷调查由经过培训的调查员对研究对象进行面对面的调查，并根据事先拟定好的结构式问卷逐项如实填写。调查内容主要包括基本人口学特征（如年龄、婚姻、职业、文化程度等），行为危险因素资料包括首次性生活年龄、性伴侣个数、孕次、产次、首次足月产年龄、分娩方式、避孕方式、性传播疾病病史以及性伴的性伴情况等等。此外，还有本人的吸烟、饮酒史，药物服用史，个人既往史和手术史、妇科病史和肿瘤家族史。1012名患者（宫颈癌患者539例和CIN患者473例）和800名对照组女性同意提供外周血进行研究，并完成问卷调查。其中，675名患者（宫颈癌患者260例和CIN患者415例）和410名对照组女性同意提供宫颈刮片的组织样本进行HR-HPV检测。杂交捕获法Ⅱ测定高危型HR-HPV DNA。结果1．HR-HPV感染率在病例组和对照组之间存在显著差异（三组比较x2=366.310，P＜0.001；两两比较，x2=137.25，P=0.000和x2=203.78，P=0.000）。在行为危险因素方面，性伴侣个数、首次性生活年龄和首次足月产年龄在三组间均无显著性差异。而产次（包括足月产和大于28周的早产或引产）在三组间的分布显著不同（x2=18.235；P＜0.001）。2．XRCC1的三个SNP和MGMT的三个SNP均不增加和减少HR-HPV感染的风险。3．将可能与宫颈癌有关的10个因素引入非条件Logistic回归模型，在显著性水平a=0.05，允许误差0.10下，采用Forward法进行分析，除了HR-HPV感染外，还有性伴侣个数、首次性生活年龄、首次足月产年龄、产次共4个因素进入回归方程。4．在HR-HPV阳性组，对于XRCC1 194位点，和野生型纯合子Arg194Arg（CC）的个体相比，变异型纯合子Trp194Trp（TT）的个体，显著增加宫颈癌的风险[OR=1.3295％Cl=（1.14-3.63）]；对于XRCC1 399位点，和野生型纯合子Arg399Arg（GG）的个体相比，携带变异型纯合子Gln399Gln（AA）和杂合子Arg399Gln（GA）的个体，均显著增加宫颈癌的风险[OR值和95％CI为1.60（1.00-2.57）和2.22（1.86-5.76）]。对于MGMT基因，在HR-HPV阳性组中，和野生型纯合子Ile143Ile（AA）的个体相比，变异型纯合子Val143Val（GG）的个体，显著增加宫颈癌的风险[OR=3.33（95％CI=1.15-9.68）]。对于MGMT 178位点来说，和野生型纯合子Lys178Lys（AA）的个体相比，变异型纯合子Arg178Arg（GG）基因型的个体，亦显著增加宫颈癌的风险[OR=3.38（95％CI=1.16-9.81）]。在HR-HPV阳性组中，六个SNP的基因型都不增加CIN的风险。由于在宫颈癌组和CIN组中HR-HPV阴性组的人数太少（分别为10.6％和14.2％），我们没有计算HR-HPV阴性组的ORs值和95％CIs。5．在HR-HPV阳性组，对于XRCC1基因，和正常人群中最常见的单体型194Arg（C）-280Arg（G）-399Arg（G）相比，带有单体型194Arg（C）-280Arg（G）-399Gln（A）、194Arg（C）-280His（A）-399Arg（G）或194Trp（T）-280Arg（G）-399Arg（G）的个体均显著增加宫颈癌的风险[OR和95％ CI分别为2.29（1.55-3.40）、1.81（1.11-2.97）和1.98（1.39-2.83）]；对于MGMT基因，和最常见的单体型84Leu（C）-143Ile（A）-178Lys（A）个体相比，带有84Phe（T）-143Val（G）-178Arg（G）单体型的个体显著增加宫颈癌的风险近2倍[OR和95％CI为3.09（1.05-9.11）]。而另外3种单倍体84Leu（C）-143Val（G）-178Arg（G）、84Leu（C）-143Val（G）-178Lys（A）和84Phe（T）-143Ile（A）-178Lys（A）均不增加宫颈癌的风险。6．在HR-HPV感染和行为危险因素的分组中，观察到在多个性伴侣、首次性生活小于20岁、产次大于3次、首次足月产小于22岁的组别中，XRCC1位点194携带至少1个Trp的个体（CT／TT）和MGMT位点178携带至少1个Arg的个体（GG+GA）均显著增加宫颈癌的风险[OR值和95％ CI分别为1.28（1.00-1.63），1.43（1.04-1.76）、1.55（1.74-3.81）、1.44（1.26-2.53）、2.58（1.23-4.41）、2.52（1.75-3.45）和3.22（1.20-4.66）]。而对于XRCC1的399位点，仅仅在HR-HPV阴性组，携带至少1个Gln的个体（GA／AA）未显示增加宫颈癌的风险。而在行为危险因素分组中，无论是否具有行为危险因素，399位点携带至少1个Gln的个体（GA／AA）均显著增加宫颈癌的风险。结论1．XRCC1 Arg194Trp、MGMT Lys178Arg及Ile143Val的基因型和单体型仅增加HR-HPV感染或具有行为危险因素女性对宫颈痛的风险，而XRCC1 Arg399Gln除HR-HPV阴性者外均增加对宫颈癌的风险，提示XRCC1 Arg399Gln是一个对宫颈癌风险度更高的SNP位点。2．XRCC1和MGMT的SNP不增加HR-HPV感染的易感性。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 两种SNP检测方法的比较
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 XRCC1和MGMT基因SNP和宫颈癌易感性的关系
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 XRCC1和MGMT基因SNP、HR-HPV感染及行为危险因素对宫颈癌易感性的多因素分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述1 宫颈癌遗传易感性的研究进展
• 综述2 肿瘤遗传背景研究中的分类热点区
• 综述3 肿瘤遗传背景研究在个体化治疗中的应用和前景
• 博士学位在读期间发表的论文
• 致谢