oxLDL的胶体金免疫层析试纸条的制备

论文摘要

心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)被喻为人类健康的第一大杀手,全球每年死于心血管疾病的人数约占全球死亡人数的三分之一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)及其并发症占了心血管疾病中相当大一部分。氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,oxLDL)通过多种途径促进动脉粥样硬化的发生、发展,是As病灶中特有的成份,两者关系密切。对oxLDL的检测成为CVD诊断的一个较为敏感的指标,对病人疾病的珍断和预防都有积极的意义。目前检测oxLDL的方法最常用的是采用oxLDL单抗的酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。胶体金快速免疫层析法(Colloidalgold enhanced immunochromatography assay,CGEIA)运用于快速珍断具有与ELISA相近敏感度,也借助单克隆抗体技术使其特异性得到保障。并同时能解决ELISA操作过程相对复杂,操作时间长,检测费用较高等缺点。本实验通过B淋巴细胞杂交瘤技术成功建立了两株能稳定分泌抗人oxLDL单克隆抗体的细胞株:A3和E11。通过小鼠腹水诱导产生,饱和硫酸铵沉淀法提纯的两株单抗均有1:25600以上的效价,其中单抗A3的相对亲和力较E11更高。经亚类试剂盒鉴定,两株单抗均为IgM。同时,通过实验掌握了胶体金的制备方法,制得胶体金清凉透明,经紫外分光光度计及透射电镜检测颗粒均一。选用20nm胶体金颗粒标记亲和力相对高的单抗A3,按照竞争法原理初步装配了胶体金快速免疫层析试纸条,并取得了预计的结果。竞争法半定量检测氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸条已申请国家专利,初审合格,公开号为CN101183108。该试纸条具有很大的市场前景与经济效益潜力。本实验为该试纸条的研发及优化提供了必要的基础和前提。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 引言
• 1 氧化低密度脂蛋白（oxLDL）与动脉粥样硬化的研究进展
• 1.1 oxLDL的形成
• 1.2 oxLDL与动脉粥样硬化
• 1.3 常见oxLDL的检测
• 2 杂交瘤及单克隆抗体技术的研究进展及应用
• 2.1 单克隆抗体的概念及制备原理、流程和方法
• 2.2 单克隆抗体的研究进展
• 2.3 单克隆抗体的应用
• 3 以膜为固相的免疫胶体金快速诊断技术的研究及应用
• 3.1 胶体金及胶体金标记物的概念和特点
• 3.2 以膜为固相的免疫层析技术的原理
• 3.3 免疫胶体金快速诊断的现状与展望
• 4 立论依据及研究意义
• 第二部分 稳定分泌抗oxLDL单抗杂交瘤细胞系的建立
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠的免疫
• 2.2 细胞的融合
• 2.3 杂交瘤细胞的筛选及培养
• 2.4 杂交瘤细胞的克隆培养
• 2.5 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.6 杂交瘤细胞的鉴定
• 2.6.1 杂交瘤细胞上清液抗体效价检测
• 2.6.2 杂交瘤细胞染色体分析
• 2.6.3 杂交瘤细胞株稳定性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 小鼠的免疫
• 3.2 细胞的融合
• 3.3 杂交瘤细胞的筛选
• 3.3.1 抗原包被量及酶稀释度的确定
• 3.3.2 融合细胞阳性孔检测结果
• 3.4 杂交瘤细胞的克隆培养
• 3.5 杂交瘤细胞的鉴定
• 3.5.1 杂交瘤细胞上清液抗体效价检测
• 3.5.2 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.5.3 杂交瘤细胞株稳定性测定
• 4 讨论
• 第三部分 抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 小鼠腹水的诱导和McAb的的纯化
• 1.2.2 腹水McAb的亚类分析
• 1.2.3 腹水McAb的亲和力比较
• 1.2.4 腹水McAb的效价测定
• 1.2.5 交叉反应性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠腹水的诱导和McAb的纯化
• 2.1.1 小鼠腹水的收集
• 2.1.2 饱和硫酸铵沉淀法纯化后腹水的蛋白含量
• 2.2 腹水McAb的亚类分析
• 2.3 腹水McAb的亲和力比较
• 2.4 腹水McAb的效价测定
• 2.5 与白蛋白的交叉反应性分析
• 3 讨论
• 第四部分 半定量检测氧化低密度脂蛋白试纸条初探
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 胶体金的制备
• 1.2.2 胶体金标记的单克隆抗体的制备
• 1.2.3 半定量检测氧化低密度脂蛋白试纸条初探
• 2 结果与分析
• 2.1 胶体金颗粒质量检测
• 2.2 蛋白质最佳用量的选择
• 2.3 金标记蛋白结果
• 2.4 免疫层析试纸条初装
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢