用AFLP-SCAR方法标记栽培小麦Brock中抗白粉病新基因

论文摘要

小麦白粉病是一种影响小麦高产、稳产的世界性病害,在我国南北麦区危害程度日趋严重。由于白粉病抗源的单一和重复使用,大部分抗白粉病基因已丧失功能。为有效控制白粉病的流行,必须大力挖掘和利用新抗源,并实行抗性基因累加,以培育抗性持久的小麦新品种。我们以抗白粉病小麦栽培种Brock、对白粉病敏感且农艺性状优良的品种京411及Brock与015和品种京411杂交、回交7代、自交1代得到的近等基因系（NILs）Brock/015//京4117中选出的抗病优良单株为材料,用AFLP方法标记普通小麦Brock中的抗白粉病新基因。1.白粉病抗性鉴定与抗性遗传用15号白粉菌生理小种对Brock、015、京411及NILs进行抗病性鉴定,亲本Brock对白粉菌表现出免疫,品系015及品种京411对白粉菌高度敏感,NILs对白粉菌表现出强抗。Brock×京411的F1代表现为抗病,说明Brock对白粉病的抗性是完全显性的,属于细胞核遗传。F2所鉴定的106个单株中,表现出抗病的有79株,表现出感病的有27株,群体分离比率符合3:1的分离比,再次证实了Brock对白粉菌的抗性属于显性单基因遗传,表明Brock中所含抗性基因是对当前北京地区白粉菌15号优势小种有效的主效抗病基因。2.Brock中白粉病抗性基因的AFLP分子标记筛选利用225个AFLP引物组合对Brock、京411及NILs进行AFLP分析,结果所有AFLP引物组合均可扩增出清晰可辨的带型,有效引物比例为100%。大多数引物都没有检测出京411和NILs之间的差异,说明这两个材料间有极相似的遗传背景。而Brock与以上两个样品间多态性较高,说明Brock与该两样品在遗传背景上差异较大。所有引物组合中有14对引物在京411与Brock和NILs之间出现21条扩增特异带。表现为有些扩增带专属于京411,在Brock和NILs中扩增不到,如引物组合P6/M3在京411中扩增到约400bp(P6/M3400)和250bp(P6/M3250)两条特异带,在Brock和NILs中没有扩增到该两条带,类似的组合还有P10/M4550、P10/M2550、P1/M4310。有些谱带在Brock和NILs中有,而在京411中没有,如引物组合P10/M7在Brock和NILs中扩增到一条分子量约为1000bp(P10/M71000)的特异带,京411中没有此带;类似的组合还有P6/M3166、P3/M6200、P3/M6500、P6/M7200、P6/M7600、P6/M3190、P6/M6280、P3/M6700、P10/M10500、P10/M2350、P6/M1480、P6/M2220、P1/M4330、P3/M1300。3.筛选出的特异片段与白粉病抗性基因的连锁性分析为检测这21个特异片段的稳定性及其与白粉病抗性基因间的连锁性和遗传距离,我们以抗病亲本Brock与感病小麦栽培种京411杂交,F1代自交后分离得到了79个抗病单株和27个感病单株,用这28个引物组合对它们进行AFLP分析。结果表明,只有引物组合P6/M3和P3/M6与抗病基因有较强连锁性。4.P6/M3163、P6/M3166、P3/M6395的克隆、测序及序列分析将P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395克隆在大肠杆菌质粒pGEM（?）-T EasyVector上,得到实际长度为163bp、166 bp和395 bp的克隆片段。送往TAKARA生物公司测序,分析测序结果:在这3个片段中未发现开放阅读框,用核苷酸序列同源性比较软件BLAST在基因核苷酸数据库GenBank中进行同源性比较分析,结果表明这3个片段与库中已知基因及序列无同源性。推知P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395是与Brock中抗白粉病新基因紧密连锁的新标记。5.SCAR标记转化SCAR marker（sequence characterized amplified region）序列特征化扩增区域标记通常是由RAPD标记或AFLP标记转化而来的。为了提高所找到的某一RAPD或AFLP标记在应用上的稳定性,可将该标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序,根据其碱基序列设计一对特异性引物（18～24 bp）,也可只对该标记片段的末端进行测序,在原来的10个碱基引物的基础上增加相邻的14个左右的碱基,成为与原来标记片段末端相配对的特异性引物。根据P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395的测序结果分别设计了一对SCAR引物,SCAR-PCR扩增结果表明,在抗病单株中出现了特异条带,在感病单株中没有出现特异条带,与AFLP扩增结果完全一致,成功的将AFLP标记转化为了SCAR标记。分子标记在作物育种中发挥着极其重要的作用,它可以用于不通过作物外部形态而通过更稳定的DNA信息筛选有某种特殊品质的作物植株,可以指示几个抗病基因的聚合,还能为作物中相关基因的图位克隆奠定坚实基础。本研究所得到的AFLP分子标记P6/M3163、P6/M3166和P3/M6395与栽培小麦Brock中抗白粉病新基因紧密连锁,向Brock中抗白粉病新基因逼近了一步。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 小麦抗白粉病抗性遗传的研究现状
• 1.2 植物抗病的分子机理
• 1.3 植物抗病基因克隆的方法及策略
• 1.4 本研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 白粉病抗性鉴定
• 2.2.2 小麦总 DNA的提取
• 2.2.3 AFLP实验程序
• 2.2.4 连锁性鉴定
• 2.2.5 特异片段的克隆
• 2.2.6 测序
• 2.2.7 AFLP标记转化为SCAR标记
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 白粉病抗性鉴定与抗性遗传分析
• 3.1.2 Brock中抗白粉病新基因的AFLP分子标记筛选
• 3.1.3 特异性片段与抗白粉病基因的连锁性分析
• 163，P6/M3₁₆₆，P3/M6₃₉₅特异片段的克隆与测序'>3.1.4 P6舰3₁₆₃，P6/M3₁₆₆，P3/M6₃₉₅特异片段的克隆与测序
• 3.1.5 SCAR标记的转化
• 3.2 讨论
• 3.2.1 AFLP实验操作的几点体会
• 3.2.2 目的片段的克隆
• 3.2.3 SCAR引物的设计原则
• 3.2.4 SCAR标记转化的探讨
• 3.2.5 SCAR标记在辅助选择育种上的可行性
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢