体外诱导兔骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的实验研究

论文摘要

目的：通过密度梯度离心法分离兔骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal stem cells,BMSCs）行体外培养,探讨BMSCs体外培养后的生物学特性,并诱导其向成骨细胞方向分化,观察其成骨过程。方法：用2%戊巴比妥钠以30mg／kg麻醉家兔后处死,分离双侧股骨、胫骨骨髓,利用密度梯度离心法结合贴壁培养分离纯化兔BMSCs,制备单细胞悬液,接种于含10%胎牛血清的L-DMEM培养液中,通过传代扩增,进一步去除未贴壁的细胞,待细胞铺满瓶底近80%后,加入0.25%胰蛋白酶消化传代培养。取生长良好的对数期第3代细胞,以1×107／L的细胞浓度接种于预置盖玻片的24孔培养板内。实验细胞分为2组：实验组使用成骨细胞诱导液,定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；对照组等量加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液继续培养。两组细胞持续培养,进行细胞成骨分化观察。主要观察指标：在倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,透射电镜观察细胞的超微结构,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,VON KOSSA染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况,并作统计分析。结果：用兔淋巴细胞分离液梯度离心结合贴壁法从骨髓中分离单个核细胞,接种于含10%胎牛血清的L-DMEM培养液。在接种后48小时贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形；72小时后出现散在的纺锤状贴壁细胞；10-14天后形成克隆。BMSCs贴壁稀疏时,长梭形细胞的两极朝向不规则,细胞排列紊乱,细胞之间往往通过突起相连接,约3周出现致密的贴壁细胞层,此时细胞的两极开始有规律的排列成束状,有的呈漩涡状。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快,P1代细胞群体倍增时间约为37小时。P3代细胞生长潜伏期为3-4天,第4-6天进入对数生长期,2周后进入平台期。流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。电镜显示BMSCs胞核呈类圆形或不规则型,核膜清晰,有1-2个核,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有绒毛。用成骨细胞诱导液定向诱导第3代BMSCs第7天,可观察到少许细胞由梭形变为多角形。随着时间的增长,多角形的细胞逐渐增多并聚集成团,14天后Von Kossa染色出现钙结节,碱性磷酸酶染色呈阳性。对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性。经诱导后的细胞碱性磷酸酶染色明显,胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀,碱性磷酸酶活性部位呈棕黑色。Vonkossa染色可见黑色的矿化结节颗粒,颗粒大小不均一,提示有矿化基质沉积。骨诱导培养三周,免疫组化SP法可检测到Ⅰ型胶原表达,在结节周围呈黄褐色,而对照组则未能表达。结论：（1）将兔骨髓基质干细胞进行体外培养,能够在较短的时间内获得大量较高纯度的干细胞,且周期短,重复性好,可作为组织工程学中种子细胞的重要来源。（2）地塞米松在骨髓基质细胞向成骨细胞转化过程中所诱导的实验组在细胞在形态和生物学特性上都较对照组更具有成骨细胞的特征,其ALP得活性和形成钙结节的能力都强于对照组细胞。（3）BMSCs在体外适合的条标件下可以向成骨细胞转化,并可检测到标志物表达的特异性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
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• 致谢
• 细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展（综述）