胃癌中HSulf-1与Hedgehog信号通路的关系研究

论文摘要

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发生与信号转导通路的异常激活有关。最近对Hedgehog（HH）信号通路的研究显示,Hedgehog信号通路的异常激活对胃癌的发生发展过程起重要作用。鉴于人芳香基硫酸酯酶（HSulf-1）会通过调控硫酸肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）的硫酸化状态进而影响Hedgehog信号通路活性,我们开展了胃癌中HSulf-1与Hedgehog等信号通路的关系研究。HSulf-1基因编码一种能在中性条件下行使功能的芳香基硫酸酯酶,在细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）中通过降低HSPGs的硫酸化程度而影响与HSPGs相关的多种胞外信号分子与其相应受体的结合过程,进而调节多种细胞信号通路的活性而改变一系列生物反应,如细胞生长、血管增生、肿瘤形成等。相关文献报导Hedgehog信号通路不仅在胚胎发育中扮演重要角色,在癌症发生发展及癌细胞生长方面也具有重要影响。本课题组早期研究发现HSulf-1基因在胃癌中由于其启动子高度甲基化而下调表达,推测异源表达HSulf-1可能会导致胃癌细胞中异常激活的Hedgehog信号通路的活性减弱。本文通过G418筛选、半定量RT-PCR及Western Blotting等方法的鉴定,成功筛选到稳定表达HSulf-1的MNK28胃癌细胞系。MTS实验结果显示,与转染空白对照的MNK28细胞相比,转染HSulf-1的MNK28细胞从第四天开始生长情况出现显著性差异（P<0.05）,转染HSulf-1的细胞的生长受到明显抑制；克隆形成实验（clone formation assay）结果显示相对于转染空白对照的MNK28细胞,转染HSulf-1的细胞克隆形成数明显减少,进一步验证了HSulf-1对细胞生长的抑制作用。HSulf-1会通过调控HSPGs的硫酸化状态进而影响Hedgehog信号通路活性,我们通过半定量RT-PCR的方法检测了实验组与对照组的Hedgehog信号通路部分下游靶基因及其C-MYC、MYCN、CCND1、BCL2等生长调控相关基因在转录上平上的表达,发现相对于转染空白对照的细胞,稳定表达HSulf-1基因的MNK28细胞中这些基因的表达均被下调；利用双荧光素酶报告系统（Luciferase assay）,检测稳转空白对照载体或HSulf-1的细胞系中Hedgehog信号通路的转录活性,实验结果表明相对于转染空白对照载体的稳转细胞,转染HSulf-1基因的稳转细胞中Gli转录因子转录活性下降80%（P<0.05）,说明HSulf-1能够显著降低Hedgehog信号通路的转录活性。根据以上实验结果,推测转染HSulf-1抑制细胞生长很可能是通过下调Hedgehog信号通路来完成。HSulf-1作为一种胞外硫酸酯酶,能在中性条件下改变HSPGs的硫酸化状态,进而影响相关信号通路信号分子与其受体结合过程而调节细胞信号通路,从而可能影响癌症的发生与发展,这提示HSulf-1可能具有潜在的医药、工业应用价值。我们尝试使用pGEX-6p-1表达载体在E.Coli中表达了HSulf-1的功能域片段,使用GST融合标签纯化了表达产物并作了酶活力测定。以4-MUS为底物的酶活力测定结果显示,原核表达的HSulf-1功能域片段在体外没有酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 绪论
• 1 引言
• 1.1 胃癌研究现状
• 1.2 Hedgehog信号通路
• 1.3 HSulf-1简介
• 2. 实验设计方案
• 2.1 实验目的与意义
• 2.2 实验流程图
• 第二章 HSulf-1稳转细胞系的筛选
• 1 实验材料与试剂
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞复苏与培养
• 2.2 大量质粒提取
• 2.3 质粒浓度测定与稀释
• 2.4 细胞转染
• 2.5 稳转细胞系的筛选
• 2.6 稳定表达HSulf-1 MNK28细胞株的鉴定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 HSulf-1对细胞生长与对Hedgehog信号通路的影响
• 1 实验材料与试剂
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 MTS实验（MTS Assay）
• 2.2 克隆形成实验（Clone Formation Assay）
• 2.3 双荧光素酶报告系统
• 2.4 半定量RT-PCR分析
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 HSulf-1重组蛋白的原核表达、分离纯化及活性测定
• 1 实验材料与试剂
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.2 重组蛋白的诱导表达与纯化
• 2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.4 蛋白质含量测定
• 2.5 HSulf-1酶活力测定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 插图索引
• 硕士期间发表论文
• 致谢