副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫研究

论文摘要

副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌即禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp．Paratuberculosis，MAP）引起的一种以反刍动物为主要宿主的慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的传染病，也称Johne’s病。该病不仅使病畜的饲料报酬降低，产奶量和繁殖力下降，造成巨大的经济损失，而且还与人类的克隆氏（Crohn’s）病存在潜在联系，因此，愈来愈受到世界各国的广泛关注。目前，该病尚无经济有效的治疗药物，控制该病的主要措施是加强饲养管理和消除传染源，即以变态反应、ELISA、病原分离鉴定等方法进行检疫，对检出的阳性牛隔离与淘汰。此外，也可采用预防接种的方法来控制该病，即将MAP灭活或致弱后制成疫苗进行免疫，接种疫苗不仅使该病的临床型病例减少90％，而且减少了亚临床感染动物的数量和组织学或细菌学检测阳性的病例。但是，菌苗接种后会干扰该病和结核病的变态反应和血清学检测，许多国家已经禁止使用接种菌苗来控制副结核病。因此，研究开发副结核病的新型疫苗势在必行。热休克蛋白（HSPs）是生物体受到物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的高度保守的蛋白质。根据分子量，将主要的热休克蛋白分为5个家族：大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。Hsp60作为一种分子伴侣，能协助变性、不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象，在许多病原体传染过程中是免疫优势抗原。hsp65基因又名groEL2基因，其编码的蛋白是HSP60家族成员，不仅可作为分枝杆菌的主要保护性抗原，还具有帮助树突状细胞递呈抗原等功能。Hsp10（GroES）作为辅分子伴侣，在GroLS指导蛋白质折叠过程中具有辅助其活性的作用，同时作为一种有效的T细胞抗原，能刺激机体产生特异性细胞免疫应答，使外周血单核细胞出现增殖反应并产生IFN-γ，是制备新型疫苗的候选抗原。为了研发预防副结核病的新型疫苗尤其是DNA疫苗及相关蛋白功能，本研究选择了MAP的主要保护性抗原Hsp65蛋白，以副结核分枝杆菌C-2株染色体DNA为模板，以hsp65基因的特异性引物进行PCR扩增，获得了1 626bp的hsp65基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中，以质粒大小、酶切分析、PCR扩增及序列分析鉴定重组克隆，成功地构建出克隆质粒pGEM-T-hsp65，以DNASTAR软件分析了所克隆基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，结果表明，所获得的hsp65基因与GenBank中MAPK-10株该基因核苷酸大小完全一致，两者核苷酸序列的同源性为99．1％，氨基酸序列的同源性为99．3％，表明该基因在副结核分枝杆菌中高度保守。进一步将pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至pET-32a（+）原核表达系统中，构建了高效原核表达质粒pET-32a-hsp65，在与之相匹配的E．coli BL21（DE3）表达菌株中，该质粒经IPTG诱导获得了76Ku的融合蛋白。经免疫印迹分析证实，该融合蛋白具有与副结核分枝杆菌多克隆抗体发生反应的特性。在上述研究的基础上，为研究开发MAP主要保护性基因hsp65的DNA疫苗，将克隆质粒pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至真核表达载体pVAX1中，成功构建了真核表达重组质粒pVAX1-hsp65，并以阳离子聚合物基因转染试剂将真核表达重组质粒转染至BHK-21细胞中，通过荧光抗体和RT-PCR技术证实hsp65基因可以在哺乳动物细胞中表达，同时将pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至pVAX1-hsp10中，成功构建了真核表达重组质粒pVAX1-hsp65-10。以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10重组质粒免疫BALB／c小鼠，同时设pVAX1、生理盐水为对照组。特异性抗体检测结果显示，免疫小鼠体内分别产生了针对Hsp65的特异性抗体，且二价基因免疫组的抗体水平高于单价基因。淋巴细胞转化试验结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组的淋巴细胞增殖活性高于生理盐水对照组，而pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10实验组之间差异不显著（P＞0．05）。CD3+、CD4+、CD8+T细胞检测结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组CD8+T细胞水平高于对照组，尚未达到统计学的显著水平（P＞0．05），但也表明实验组产生了较高的以MHCⅠ类分子递呈的细胞免疫应答，pVAX1-hsp65免疫组的CD4+、CD3+T细胞数量明显高于其它组。重组质粒pVAX1-hsp65-10免疫组小鼠的IFN-γ水平明显高于对照组，pVAX1-hsp65免疫组的小鼠IFN-γ水平略高于对照组，均未达到统计学上的显著水平（P＞0．05），但结果显示，重组质粒pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10均使免疫小鼠产生了细胞免疫，而且二价基因的免疫效果优于单价基因。以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫豚鼠，同时设pVAX1和副结核分枝杆菌超声抗原对照组。禽结核杆菌PPD皮试结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组与副结核分枝杆菌超声抗原免疫组差异极显著（P＜0．01），表明Hsp65和Hsp10不干扰变态反应检测。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 前言
• 1.副结核病的危害
• 2.副结核分枝杆菌的生物学特性
• 3.副结核分枝杆菌的分子生物学特征
• 4.野生动物与副结核病
• 5.副结核病的基因分型技术与分子流行病学
• 6.副结核分枝杆菌与克隆病
• 7.副结核分枝杆菌相关蛋白研究进展
• 8.副结核病的发病机制
• 9.副结核病的诊断
• 10.防治
• 11.核酸疫苗
• 12.热休克蛋白
• 13.热休克蛋白60
• 14.本研究的目的和意义
• 第二部分 实验内容
• 实验一 副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 副结核分枝杆菌染色体基因组DNA的提取
• 3.2 目的基因的PCR扩增产物
• 3.3 重组克隆的筛选及鉴定
• 3.4 目的基因的序列测定与分析
• 4 讨论
• 4.1 目的基因的选择
• 4.2 PCR扩增及其它反应条件的优化
• 4.3 基因克隆的载体
• 4.4 外源DNA转化入宿主菌的原理和影响因素
• 4.5 hsp65基因的核苷酸序列作为分枝杆菌进化指征的依据
• 4.6 目的基因的序列分析
• 5 小结
• 实验二 副结核分枝杆菌hsp65基因的原核表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 原核重组表达质粒的构建
• 3.2 阳性重组表达质粒的鉴定
• 3.3 SDS-PAGE分析
• 3.4 Western blot分析
• 4 讨论
• 4.1 融合表达和非融合表达
• 4.2 表达系统
• 4.3 目的蛋白的纯化与功能
• 5 小结
• 实验三 副结核分枝杆菌hsp65基因真核表达载体的构建及表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 真核表达质粒的构建
• 3.2 重组表达质粒的鉴定
• 3.3 质粒的含量和纯度
• 3.4 荧光抗体检测
• 3.5 RT-PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 表达载体与转染方法的选择
• 4.2 Hsp65抗原性的初步分析
• 4.3 串联质粒的作用
• 5 小结
• 实验四 副结核分枝杆菌hsp65基因对实验动物的免疫研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 重组表达质粒的纯度
• 3.2 免疫小鼠淋巴细胞转化试验
• +T、CD4⁺T、CD8⁺T细胞数量'>3.3 免疫小鼠CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T细胞数量
• 3.4 免疫小鼠血清中特异性抗体水平
• 3.5 免疫小鼠IFN-γ的检测
• 3.6 免疫豚鼠变态反应检测
• 4 讨论
• 4.1 Hsp10蛋白
• 4.2 免疫时加入普鲁卡因的作用
• 4.3 免疫小鼠的细胞免疫应答
• 4.4 免疫小鼠血清中特异性抗体水平
• 4.5 免疫豚鼠的变态反应
• 4.6 对今后研究的设想
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介