广西猪PRV分子病原学调查及快速鉴别野毒感染双功能性分子的构建

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的一种高度接触性传染病,给我国的养猪业造成巨大的经济损失。目前虽然已经建立了区分疫苗免疫和野毒PR感染的PCR和ELISA方法,但是这些方法均需要特殊的仪器和有工作经验的人员进行操作,不适合基层生产单位使用,因此迫切需要一种简便、快速的鉴别诊断方法。基于国内广泛应用gE基因缺失苗进行免疫的现状,利用红细胞凝集试验的原理,将一种抗人红细胞非凝集型单抗的单链抗体基因（2E8）与PRV-gE抗原表位基因融合,构建一种用于快速鉴别PRV野毒株感染的重组双功能分子,建立一种利用红细胞凝集试验进行PR野毒感染的鉴别诊断方法。若该诊断方法研制成功,将对该病的快速诊断具有重要的作用。为了获得双功能性分子中PRV gE抗原肽,并摸清当前广西PRV的流行病学情况和遗传变化规律,对来源于广西13个地（市）122个不同规模猪场163份病料进行PCR鉴定,结果检测出PRV阳性6份,阳性率3.7%;gE-ELISA血清学检测玉林、南宁、桂林、贵港等8个规模猪场的61份血清,其中7份呈阳性,阳性率11.5%。对6株PRVgE胞外基因进行序列测定,并同国内外PRV代表株及广西地方株相应基因序列进行比较,结果显示6株毒株同国内毒株MinA株、GXB株、GXW株、Ea株、SH株、LA株核苷酸同源性在97.8～99.0%之间,氨基酸同源性为96.5～99.0%,与国外毒株Rice株核苷酸和氨基酸同源性最低,分别为96.4～97.0%,93.6～95.2%。研究表明,广西PRV同国内毒株亲缘关系密切,变异情况不大;调查显示PR的检出率并不高,说明我区PR的防控工作已初见成效,但调查表明一些规模猪场仍存在PRV隐性感染的情况,这提醒我们PRV防控工作仍不能放松。将筛查出的6份PRV阳性样品进行病毒的分离工作,目前仅分离出一株PRV病毒。该病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价(TCID50)为10-7.22/0.1ml,PCR扩增出与目的片段大小相符的带,与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与其它5株广西毒株及国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.4%～99.8%之间,氨基酸同源性在97.8%～99.4%之间,与国外毒株Rice株相比,核苷酸和氨基酸的同源性均较低,分别为97.0%和95.2%,结果证实该分离毒为伪狂犬病病毒,命名为GXBB-1株。将该病毒株gE胞外基因作为构建双功能分子的抗原肽部分进行试验。用oligo软件设计构建2E8-gE融合基因的引物,将抗人红细胞H抗原的单链抗体基因2E8同GXBB PRV gE胞外基因,利用SOE PCR方法拼接起来,并回收片段,同PMD18-T simple vector连接,经PCR、测序鉴定成功实现了两段基因的连接,且读码框正确。将重组质粒PMD-2E8-gE进行双酶切（BamHI和EcoRI）,回收2E8-gE片段,并与同样双酶切的表达载体PET-His连接,经双酶切和PCR鉴定成功构建了表达重组质粒PET-His-2E8-gE。为进一步表达2E8-gE蛋白,从而建立PRV快速诊断试剂盒打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩写词
• 第一章 文献综述
• 1.伪狂犬病研究进展
• 1.1 PR的生物学特征
• 1.2 PR的流行病学
• 1.3 实验室诊断方法的研究进展
• 2.gE基因缺失苗及应用情况
• 2.1 gE基因结构
• 2.2 gE基因缺失苗及应用
• 2.3 gE糖蛋白在根除PR中的作用
• 3.自体红细胞凝集试验
• 3.1 原理
• 3.2 红细胞的选择
• 3.3 抗红细胞抗体与免疫原性蛋白/病原物抗体的选择
• 3.4 双功能性分子
• 4.本课题研究的目的和意义
• 第二章 广西猪伪狂犬病的分子病原学调查及gE基因的克隆及分析
• 1.材料与试剂
• 2.实验方法
• 2.1 病料调查资料的整理
• 2.2 引物的设计
• 2.3 病毒DNA的提取
• 2.4 目的基因的扩增
• 2.5 目的基因的克隆
• 2.6 gE-ELISA血清学诊断
• 3.结果
• 3.1 分子流行病学检测
• 3.2 病料调查资料的归纳整理
• 3.3 gE基因的克隆及分析比较
• 3.4 血清学调查
• 4.小结与讨论
• 第三章 广西伪狂犬病病毒GXBB-1株的分离鉴定
• 1.材料和试剂
• 2.实验方法
• 2.1 病料处理
• 2.2 病毒分离
• 50)测定'>2.3 病毒的组织培养半数致死量(TCID₅₀)测定
• 2.4 病毒DNA的提取
• 2.5 PCR鉴定
• 2.6 GXBB PRV gE基因序列分析比较
• 3.结果
• 3.1 动物接种试验
• 3.2 病毒的分离
• 3.3 PCR鉴定
• 50)的测定'>3.4 病毒毒价(TCID₅₀)的测定
• 3.5 gE基因的分析比较
• 4.小结与讨论
• 第四章 用于鉴别疫苗株与野毒株双功能性分子的构建
• 1.材料和试剂
• 2.实验方法
• 2.1 技术路线图
• 2.2 引物的设计与合成
• 2.3 融合基因的拼接
• 2.4 表达载体PET-His-2E8-gE质粒的构建
• 3.结果
• 3.1 2E8-gE融合基因的构建
• 3.2 2E8-gE融合基因的克隆及序列分析
• 3.3 PET-His-2E8-gE重组质粒的构建
• 4.小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况