海洋弧菌QY103褐藻胶裂解酶的研究

论文摘要

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖单元通过1,4糖苷键聚合而成的线性大分子,主要存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻的细胞壁和细胞间质。另外,假单胞菌属、固氮菌属等细菌也可以产生胞外褐藻胶,但在β-D-甘露糖醛酸的2位或3位上发生O-乙酰化。铜绿假单胞菌是临床最常见的条件致病菌之一,它产生的乙酰化褐藻胶决定其生物膜（biofilm）的结构和功能;一旦形成生物膜,铜绿假单胞菌将具有极强的抗生素耐药性（比浮游细菌高100-1000倍）和逃避机体免疫系统攻击的能力,导致临床上持续性、难治性感染。因此,乙酰化褐藻胶是铜绿假单胞菌重要的致病因子。褐藻胶裂解酶能通过β-消去反应裂解褐藻胶的1,4糖苷键,在非还原性末端生成带有C4,5双键的不饱和糖醛酸。褐藻胶裂解酶在褐藻胶寡糖制备、防治铜绿假单胞菌感染、海藻研究等方面具有巨大应用前景,尤其在防治铜绿假单胞菌感染方面可能为解决细菌的耐药性开辟新途径。但目前所发现的褐藻胶裂解酶只有少数几种可以降解细菌产生的乙酰化褐藻胶,且比活力低,受人体中各种离子(如Ca2+、Zn2+)的抑制作用较大,所以难以用于临床治疗。因此,高活力、高特异性的褐藻胶裂解酶的发现就成为研究的热点。本文利用以褐藻胶为唯一碳源的选择性培养基,从青岛近海筛选到褐藻胶裂解酶产量较高的菌株32株,其中菌株QY103酶活力最高,对褐藻胶和乙酰化褐藻胶的酶活分别达到5.87 U/mL和4.22 U/mL。通过形态观察、生理与生化特征测定、系统发育学分析,将菌株QY103鉴定为弧菌属细菌。经过条件优化,得到弧菌QY103最佳发酵培养基配方（%, w/v）:褐藻酸钠0.5,NH4NO3 0.2,KH2PO4 0.4,K2HPO4 0.6,NaCl 3.0,MgSO4 0.01,FeSO4 0.01,pH 5.5。最佳发酵条件为:按3%（v/v）接种量接种培养基,28℃150 r/min振荡培养72 h。优化后,QY103到达产酶高峰的时间由4天缩短到3天,褐藻胶裂解酶最高产量由5.87 U/mL提高到45.26 U/mL,增加了6.71倍。利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析从弧菌QY103发酵液上清中纯化到一种新褐藻胶裂解酶,纯化15.13倍,得率为29.81%。SDS-PAGE表明达到电泳纯,分子量为35.6 kDa,命名为AlyVII。褐藻胶裂解酶AlyVII的比活力为1863.45 U/mg,最适温度40℃,在30℃下稳定;最适pH 6.0,在pH 5-9之间比较稳定;Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、EDTA能促进酶活性,而Mn2+、Ni2+、Fe2+、SDS能抑制酶活性。褐藻胶裂解酶AlyVII能降解各种来源（包括褐藻和铜绿假单胞菌）的褐藻胶,对褐藻来源的褐藻胶和poly（M）片段降解能力更强。利用96孔板模型和flow cell模型检测了褐藻胶裂解酶AlyVII对7株铜绿假单胞菌菌株生物膜形成的抑制作用和对已形成生物膜的清除作用。AlyVII对其中6株具有抗生物膜作用,总有效率达到85.7%。50μg/mL AlyVII即对4株菌株生物膜形成的抑制率超过80%,对6株菌株生物膜的清除率为35.28%-65.77%。100μg/mL AlyVII则对5株菌株生物膜形成的抑制率和对已形成生物膜的清除率均超过80%。褐藻胶裂解酶AlyVII与庆大霉素联合使用,能提高庆大霉素对其中6株菌株生物膜内细菌的杀灭能力,使其MBEC降低16-64倍。褐藻胶裂解酶AlyVII对铜绿假单胞菌的生长略有促进作用。以上结果表明, AlyVII是第一个从弧菌中发现的能高效降解乙酰化褐藻胶的新褐藻胶裂解酶,能有效抑制和清除铜绿假单胞菌生物膜,且在囊性纤维化（CF）病人痰液中存在的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+等离子能促进AlyVII的活性。因此,AlyVII有望发展成为一种辅助治疗铜绿假单胞菌生物膜相关感染的药物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一 文献综述
• 1 褐藻胶
• 1.1 褐藻胶的来源
• 1.2 褐藻胶的结构
• 1.3 褐藻胶的应用
• 1.3.1 褐藻胶在食品行业中的应用
• 1.3.2 褐藻胶在医药行业中的应用
• 1.3.3 褐藻胶在农业中的应用
• 1.3.4 褐藻胶在工业中的应用
• 1.3.5 褐藻胶在其他方面的应用
• 1.4 褐藻胶寡糖的应用
• 1.4.1 褐藻胶寡糖在医药行业中的应用
• 1.4.2 褐藻胶寡糖在食品行业中的应用
• 1.4.3 褐藻胶寡糖在农业中的应用
• 1.5 细菌褐藻胶的生物合成
• 1.5.1 细菌中褐藻胶生物合成的机制
• 1.5.2 细菌中褐藻胶生物合成的调控
• 1.6 褐藻胶在P. aeruginosa 中的生物学功能
• 1.6.1 细菌生物膜的定义
• 1.6.2 细菌生物膜的形成
• 1.6.3 褐藻胶在 P. aeruginosa 中的生物学功能
• 2 褐藻胶裂解酶
• 2.1 褐藻胶裂解酶的来源
• 2.2 褐藻胶裂解酶的作用机制
• 2.3 褐藻胶裂解酶的分类
• 2.4 褐藻胶裂解酶的性质
• 2.5 褐藻胶裂解酶的生物学功能
• 2.5.1 褐藻胶裂解酶在不产生褐藻胶的生物中的作用
• 2.5.2 褐藻胶裂解酶在产生褐藻胶的细菌中的作用
• 2.6 褐藻胶裂解酶的应用
• 2.6.1 用于制备褐藻胶寡糖
• 2.6.2 用于防治 P. aeruginosa 感染
• 2.6.3 用于制备褐藻原生质体
• 2.6.4 用于分析褐藻胶的结构和制备结构特异的褐藻胶
• 二 海洋弧菌 QY103 的筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.1.1 分离培养基
• 1.1.2 Zobell 2216E 培养基
• 1.1.3 TCBS 培养基
• 1.1.4 Luria-Bertani（LB）培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 褐藻胶裂解酶产生菌株的筛选
• 1.4.1 富集培养
• 1.4.2 初筛
• 1.4.3 复筛
• 1.5 乙酰化褐藻胶的制备
• 1.6 褐藻胶裂解酶活性测定方法
• 1.7 形态观察与生理生化实验
• 1.8 16S rDNA 的克隆与菌株分子系统学鉴定
• 1.8.1 基因组 DNA 的提取
• 1.8.2 16S rRNA 基因的克隆与序列测定
• 1.8.3 数据分析
• 2 结果
• 2.1 筛选结果
• 2.2 形态特征
• 2.3 生长条件
• 2.4 生理生化特征
• 2.5 16S rRNA 基因序列分析和分子系统学鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 三 褐藻胶裂解酶产生菌 Vibrio sp. QY103 的发酵条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 粗酶的制备
• 1.5 褐藻胶裂解酶活性测定方法
• 2 结果
• 2.1 碳源对产酶的影响
• 2.2 氮源对产酶的影响
• 2.3 无机盐对产酶的影响
• 2.3.1 NaCl 浓度对产酶的影响
• 2+浓度对产酶的影响'>2.3.2 Mg²⁺浓度对产酶的影响
• 2+浓度对产酶的影响'>2.3.3 Fe²⁺浓度对产酶的影响
• 2.4 初始pH 对产酶的影响
• 2.5 接种量对产酶的影响
• 2.6 培养温度对产酶的影响
• 2.7 转速对产酶的影响
• 2.8 优化前后产酶的比较
• 3 讨论
• 4 小结
• 四 Vibrio sp. QY103 褐藻胶裂解酶 AlyVII 的分离纯化与性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.1.1 发酵培养基
• 1.1.2 Luria-Bertani（LB）培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 粗酶的制备
• 1.5 褐藻胶裂解酶AlyVII 的分离纯化
• 1.5.1 硫酸铵分级沉淀
• 1.5.2 离子交换层析
• 1.5.3 凝胶过滤层析
• 1.6 褐藻胶裂解酶活性测定方法
• 1.7 蛋白质含量测定方法
• 1.8 SDS-PAGE
• 1.9 褐藻胶裂解酶AlyVII 的性质分析
• 1.9.1 温度对酶AlyVII 的影响
• 1.9.2 pH 对酶AlyVII 的影响
• 1.9.3 金属离子、EDTA、SDS 对酶AlyVII 的影响
• 1.9.4 酶AlyVII 的底物特异性
• 1.10 乙酰化褐藻胶的制备
• 1.11 糖醛酸含量的咔唑（Carbazole）法测定
• 1.12 褐藻胶乙酰化程度的测定
• 2 结果
• 2.1 褐藻胶裂解酶AlyVII 的分离纯化
• 2.1.1 硫酸铵分级沉淀
• 2.1.2 离子交换层析
• 2.1.3 凝胶过滤层析
• 2.1.4 SDS-PAGE
• 2.2 褐藻胶裂解酶AlyVII 的性质分析
• 2.2.1 温度对酶AlyVII 的影响
• 2.2.2 pH 对酶AlyVII 的影响
• 2.2.3 金属离子、EDTA、SDS 对酶AlyVII 的影响
• 2.2.4 酶AlyVII 的底物特异性
• 3 讨论
• 4 小结
• 五 褐藻胶裂解酶 AlyVII 抗铜绿假单胞菌生物膜作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.1.1 发酵培养基
• 1.1.2 Luria-Bertani（LB）培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 褐藻胶裂解酶AlyVII 的制备
• 1.5 褐藻胶裂解酶活性测定方法
• 1.6 蛋白质含量测定方法
• 1.7 铜绿假单胞菌生物膜静态模型――96 孔板模型
• 1.8 铜绿假单胞菌生物膜动态模型――Flow cell 模型
• 1.8.1 质粒pMRP9-1 的提取
• 1.8.2 菌株P. aeruginosa CS1－pMRP9-1 的构建
• 1.8.3 Flow cell 实验
• 1.9 抗生素的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
• 1.10 抗生素的最低生物膜消除浓度的测定
• 1.11 褐藻胶裂解酶 AlyVII 对铜绿假单胞菌生长的影响
• 2 结果
• 2.1 褐藻胶裂解酶AlyVII 的制备
• 2.2 菌株 P. aeruginosa CS1-pMRP9-1 的构建
• 2.3 褐藻胶裂解酶AlyVII 对生物膜形成的抑制作用
• 2.3.1 96 孔板模型
• 2.3.2 Flow cell 模型
• 2.4 褐藻胶裂解酶AlyVII 对已形成的生物膜的清除作用
• 2.4.1 96 孔板模型
• 2.4.2 Flow cell 模型
• 2.5 褐藻胶裂解酶AlyVII 对抗生素杀灭生物膜内细菌的增强作用
• 2.6 褐藻胶裂解酶AlyVII 对铜绿假单胞菌生长的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历