论文摘要
炎症是机体对损伤因子作出的防御性反应,比如对病原体,受损细胞,或刺激物的应激反应,对维持机体的正常生理功能有重要作用。同时炎症也是常见的基本病理过程,慢性炎症会导致组织的渐进式破坏,从而引起病变,如牙周炎,动脉粥样硬化,风湿性关节炎,甚至癌症。本研究从炎症反应入手,研究新的BAFF抑制剂用于自身免疫性疾病的治疗,同时以实验室FADD-/-TgD小鼠为研究对象,探讨FADD磷酸化与肠炎的关系。1.目前BAFF已成为治疗自身免疫疾病的新的药物靶点。围绕BAFF展开的药物研究也逐渐增多,随着理论研究的不断深入,对于BAFF形式的多样性的理解也更加丰富,相关的BAFF抑制剂也从最早针对sBAFF的特异性抗体药物belimumab,发展到其它各种抗体类药物和融合蛋白类药物,如atacicept （TACI-Ig融合蛋白）等,再到针对sBAFF和膜结合BAFF的blisibimod等。鉴于此,本研究从K562细胞系中获得人源的游离态BAFF （sBAFF）的基因序列,并通过重组延伸PCR对编码BAFF "Flap区”的217-224位氨基酸的序列进行突变,分别构建了表达sBAFF及其突变体mBAFF的重组质粒pET21a-sBAFF、 pET21a-mBAFF,以期模拟BAFF的60聚体及三聚体形式。同时BAFF多聚体形式与膜结合形式更易与TACI结合从而启动多聚体依赖的信号转导作用,故本研究中从小鼠脾脏组织中,获得编码TACI CRD2区域与BR3的配体结合区域的基因序列,通过（GGGGS） 3连接肽对TACI CRD2区域与BR3的配体结合区域进行融合,模拟TACI的结构,增强CRD1区域与BAFF的结合,构建TACI-CRD2、TACI-BR3、BR3-TACI三个克隆。对构建成功的pET21a-sBAFF及pET21a-mBAFF,利用大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,并对温度、IPTG浓度等影响目的蛋白表达的因素进行优化,确定重组蛋白表达的最适条件,提高目标蛋白表达量及可溶性蛋白含量。结果表明sBAFF的最适诱导条件为28℃,1 mM IPTG,降低温度可显著提高其可溶性蛋白的含量,此条件下,sBAFF的表达量占总蛋白的比例分别为30.1%,上清中目标蛋白的含量提高到25.1%。同时在28℃,1 mM IPTG对mBAFF的诱导表达,在大肠杆菌BL21中mBAFF的表达量占总蛋白的17.1%,可溶性蛋白占总表达量的比例为63.4%。对pET28a-TACI-CDR2、pET28a-TACI-BR3、 pET28a-BR3-TACI的诱导表达结果表明,在37℃、1mM IPTG诱导条件,TACI-CRD2、TACI-BR3、BR3-TACI三种蛋白的表达量占总蛋白的比例分别为25.4%、23.0%、27.4%,可溶性蛋白在目标蛋白中的含量分别为68.6%、61.3%、81.9%。三种BAFF受体突变体蛋白的表达,为后期的蛋白纯化及其生物学功能的研究奠定基础。2. FADD作为细胞凋亡通路的关键蛋白,在Fas/FasL信号通路中起着重要的作用。FADD通过其与Caspase-8共有的死亡效应结构域（DED）招募Caspase-8,造成Caspase-8的活化和其后的Caspase级联反应,最终导致细胞的死亡。本研究以FADD突变致小鼠免疫性肠炎为研究对象,通过基因鉴定筛选FADD-/-gD小鼠,并初步分析小肠组织内相关炎症因子的mRNA表达水平,为后期探究FADD突变致小鼠免疫性肠炎的机制提供思路。病理研究发现,FADD-/-TgD小鼠的小肠明显水肿变粗,小肠上皮内出现巨噬细胞和粒细胞浸润,表明FADD-/-TgD小鼠肠炎的发生；通过荧光定量PCR技术,分析了肠炎内各炎症因子mRNA水平的表达状况,与FADD+/TgD小鼠相比,FADD-/-TgD小鼠小肠中TNF-α、INFγ、MCP-1、IL17、CXCL12、cPLA2的mRNA表达水平均显著上调,TLR4、IL-1β的表达也上调,TGFP表达出现下调。