金乌贼和真蛸视神经节蛋白质组学的研究

论文摘要

金乌贼（Sepia esculenta）和真蛸（Octopus vulgaris）属于软体动物门头足类（Cephalopoda class）动物。头足类神经系统分化程度较高,易于解剖分离,适合于神经科学的研究。本论文采用双向凝胶电泳（2D-PAGE）技术分别分离金乌贼视神经节的全蛋白质,并比较了TCA/丙酮沉淀法、缓冲液法、柱层析法、裂解液法和裂解液-超速离心法分别分离和提取神经节蛋白质的优劣结果后,确立了以裂解液-超速离心法为提取神经节蛋白质的最佳方法。此外,还对载体两性电解质的pH范围、第一向等电聚焦（IEF）上样量、第二向聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离胶浓度等内容进行优化,建立了一套具有较好分辨率和重复性特点,并适合于金乌贼和真蛸神经系统蛋白质组学研究的2D-PAGE分离技术。采用优化后的2D-PAGE技术分离金乌贼视神经节和脑神经节蛋白质组,并选用质量肽指纹谱（PMF）技术和数据库检索方法对2D-PAGE图谱上的蛋白质斑点进行逐一鉴定,初步构建了金乌贼视神经节和脑神经节的分子解剖图谱。从该图谱中可看出,脑神经节的蛋白质斑点数明显多于视神经节的蛋白质斑点数。在鉴定蛋白质过程中,发现在视神经和脑神经节中都有高匹配率的线粒体苹果酸脱氢酶前体（mitochondrial malate dehydrogenase precursor,pre-MDH）和可溶性NSF连接蛋白（SNAP-type proteins）。此外,匹配率较高还有的延长因子G（elongation factor G）、微管蛋白（tubulin）和肌动蛋白（actin）等。在甲醇胁迫下,选用差异蛋白质组学研究真蛸视神经节的差异蛋白质,并采用气相色谱法证明在真蛸视神经节中含有甲醇组分,并计算其浓度。利用优化后的2D-PAGE技术,构建真蛸视神经节经甲醇处理前后的差异蛋白质组,发现共有18个蛋白质斑点出现较为明显的变化,其中有6个蛋白质斑点下调,7个蛋白点上调,2个蛋白质斑点消失,3个蛋白点增加。采用PMF技术和数据库检索比对法鉴定这些差异蛋白质,发现其中高匹配率的上调蛋白质有β-微管蛋白（beta -tubulin）、β-肌动蛋白（beta-actin）;其它比较有意义的差异蛋白质是上调的3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、琥珀酰辅酶A合成酶（Succinyl-CoA synthetase,SCS）阿尔法亚单位,下调蛋白假定的ABC转运蛋白（putative ABC transporter:ATP binding protein）,上调（增量）的醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）和长链脂酰辅酶A脱氢酶（Acyl-CoA dehydrogenase long-chain specific,LACD）。作者认为微管蛋白和肌动蛋白的异常表达可能会直接导致真蛸的失明。采用LOCtree软件对18个差异蛋白质进行亚细胞定位,发现其中归属于线粒体的差异蛋白质最多,占了总差异蛋白质数量的38.89%,说明甲醇毒性对线粒体生理功能产生极大的影响,作者推测对线粒体具有保护作用的化合物可能有助于对甲醇中毒的治疗。通过比较与分析,作者发现这些差异蛋白质之间构成一个相互影响的复杂网络,它反映了神经细胞受甲醇毒性诱导后,细胞内蛋白质结构与功能出现的异常变化现象,这将对我们深入了解甲醇对神经系统产生毒性的作用机制、生物体对甲醇中毒的反应和耐受机制、以及甲醇中毒的治疗提供有益的帮助。本论文通过蛋白质组学分析技术对头足类神经系统进行了蛋白质组学研究,并构建了在甲醇胁迫下,神经节表达的差异蛋白质组。相关研究尚未有详细的研究报道,其研究意义重大。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 一、头足类动物简介及其神经系统组成情况
• 1.1 头足类动物简介
• 1.2 头足类动物眼的结构
• 1.3 头足类动物神经系统的组成
• 二、蛋白质组学及其进展
• 2.1 蛋白质组学的概念
• 2.2 蛋白质组学研究的主要技术手段
• 2.3 蛋白质组学研究中的新技术
• 三、蛋白质组学在神经生物学研究中的应用
• 3.1 神经系统基本结构的蛋白质组学研究
• 3.2 蛋白质组学在神经系统疾病诊断中的应用
• 3.3 蛋白质组学在阐明神经系统疾病发病机制中的应用
• 3.4 蛋白质组学在神经系统疾病新药开发中的应用
• 3.5 蛋白质组学与蛋白质网络
• 四、甲醇中毒对神经系统的毒理研究
• 4.1 甲醇概述
• 4.2 甲醇对神经系统的毒理研究
• 4.3 人体甲醇中毒后的治疗
• 五、本论文的研究内容及其意义
• 第二章 材料与方法
• 一、试验材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 常用试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 实验试剂的配制
• 二、实验方法
• 2.1 实验动物处理
• 2.2 双向凝胶电泳样品的制备
• 2.3 蛋白含量的测定
• 2.4 第一向等电聚焦电泳
• 2.5 平衡及第二向SDS-PAGE 电泳
• 2.6 凝胶的硝酸银染色
• 2.7 银染后的蛋白质的肽质量指纹鉴定
• 2.8 甲醇的气相色谱分离
• 第三章 结果与讨论
• 一、优化金乌贼视神经节蛋白质组双向凝胶电泳分离技术
• 1.1 不同样品制备方法蛋白质提取率的比较
• 1.2 蛋白质组双向凝胶电泳分离
• 1.3 双向凝胶电泳技术的改进
• 二、金乌贼视神经节蛋白质组学的初步研究
• 2.1 金乌贼视神经节蛋白质组学
• 2.2 结果与讨论
• 三、甲醇胁迫下真蛸视神经节的差异蛋白质组学
• 3.1 甲醇胁迫下真蛸形态及解剖学上的变化
• 3.2 气相色谱法检测实验组真蛸视神经节中的甲醇
• 3.3 甲醇胁迫下真蛸视神经节差异蛋白质组学
• 3.4 结果与讨论
• 第四章 小结
• 附录：部分蛋白质斑点的 PMF 图谱
• 缩略语表
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢