转基因棉花突变体的鉴定和生理指标分析

论文摘要

植物转基因技术是定向改良植物性状、高频诱发突变体产生的一条有效途径,对于作物品种的改良和新品种选育具有重要意义。本研究以导入转座活化结构的不同陆地棉转基因株系后代为材料,通过分子生物学手段对主要转基因株系进行了初步鉴定及其诱发突变的效应,并初步分析了相关突变材料在生理生化代谢方面的差异。其主要结果如下:1.以筛选基因NPTⅡ基因为特异性引物时,在4105为受体的转基因株系中的扩增阳性率为26.1%,以1107为受体的转基因株系的扩增阳性率为27.2%。两种受体材料的转化效率比较接近;以Bar基因为引物时,转基因4105和1107的后代株系的扩增阳性率分别为28.1%和31.8%。通过分析可得出只含Bar基因的植株共122株,占被分析植株的比例为17.4%。说明Ds发生了转座,并与Ac因子产生了分离,有利于得到具有稳定遗传效应的突变材料。2.对T3代部分转座活化的棉株进行Southern Blotting分析,初步证明外源基因已整合到棉花基因组中。3.转基因棉花株系的主要生理指标的测定结果为:4105的L3株系在叶绿素含量和光合速率上与对照呈极显著差异,1107为受体的L9株系在蕾期与对照相比存在显著差异,在花铃期和吐絮期与对照的差异达到极显著水平,间接说明转座活化结构中的35S四联体增强子可影响插入位点附近的基因表达。此外,以4105为受体的转基因株系的叶绿素含量和光合速率均高于以1107为受体的转基因株系,说明转基因的受体不同产生的突变效应也存在差异。总体来看,4105转基因棉花株系中产生的晚熟类型的变异较多;而1107转基因株系中出现的早熟类型的变异较多。4.通过对不同转基因株系叶片可溶性蛋白质进行SDS-PAGE,得到结果如下:转基因棉花突变体在某些蛋白亚基的表达量上高于对照,尤其是分子量大约为50kD的亚基。此外,在相同的环境条件下,转基因棉花突变系的SDS-PAGE图谱中还出现了一条大约42kD的蛋白质条带,而在对照中则不存在此条带,说明导入转座活化结构的棉花后代株系中可能存在由增强子引起的蛋白质的“超表达”情况,但与该亚基相关的蛋白质的功能还需进一步的实验验证。5.对不同转基因株系叶片中POD同工酶进行PAGE,发现转基因棉株突变体酶谱与对照之间的差异。说明转座结构的插入能引起某些基因的“过量”表达,从而影响转基因棉花的相关生理代谢。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 前言
• 1. 概述
• 2. 棉花基因工程现状
• 2.1 棉花转基因技术
• 2.2
• 2.2.1 农杆菌介导法
• 2.2.2 基因枪轰击法
• 2.2.3 花粉管通道法
• 3. 插入突变
• 3.1 农杆菌介导的T-DNA插入突变
• 3.2 转座子插入突变
• 4. 植物生理代谢研究
• 4.1 代谢组学研究
• 4.2 代谢组学应用
• 4.2.1 在基因功能研究中的应用
• 4.2.2 在转基因植物的代谢研究中的应用
• 4.2.3 在植物生理变化过程研究中和农业生产中的应用
• 4.2.4 监测植物体内代谢产物的变化
• 4.3 代谢组学研究的技术
• 4.4 与代谢组学有关的代谢途径和生物化学数据库
• 4.5 转基因棉花代谢方面研究近展
• 4.5.1 棉花的光合特性研究
• 4.5.2 棉花的其他代谢表型分析
• 5. 研究目的与意义
• 第二章 转基因棉花植株的分子检测
• 1 实验材料
• 1.1 棉花材料
• 1.2 Ac/Ds转座活化结构
• 2 试验方法
• 2.1 材料的田间种植
• 2.2 转基因棉花植株的PCR检测
• 2.3 转基因植株的Southern杂交检测
• 2.3.1 棉花基因组DNA的提取
• 2.3.2 DNA的定量
• 2.3.3 转基因棉花植株的Southern杂交检测
• 3 结果分析
• 3.1 转基因棉花植株的PCR检测
• 3.1.1 NPTⅡ基因引物的PCR扩增结果
• 3.1.2 Bar基因引物的PCR扩增结果
• 3.2 Ac/Ds转座活化结构插入植株的Southern Blotting检测
• 第三章 转基因棉花植株的主要生理指标分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 转基因棉花的主要生理指标测定
• 2.1.1 光合速率的测定
• 2.1.2 可溶性糖含量的测定
• 2.1.3 叶绿素含量的测定
• 2.2 可溶性蛋白质的含量测定及其SDS-PAGE
• 2.2.1 叶片可溶性蛋白质的提取
• 2.2.2 蛋白质含量测定
• 2.2.3 SDS-PAGE
• 2.3 POD同工酶的提取和电泳
• 2.3.1 POD同工酶的提取
• 2.3.2 POD同工酶的电泳
• 2.4 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因棉花植株的主要生理生化指标变化
• 3.1.1 叶绿素含量的变化
• 3.1.2 光合速率变化
• 3.1.3 可溶性蛋白质的含量变化
• 3.1.4 可溶性糖的含量变化
• 3.2 不同转基因棉花株系可溶性蛋白质的SDS-PAGE分析
• 3.3 不同转基因棉花株系POD同工酶图谱的分析
• 4 讨论
• 4.1 转基因棉株的分子检测
• 4.2 转基因植株的主要生理指标分析
• 参考文献
• 致谢
• 附录