RNA干扰沉默食管鳞癌细胞HIF-1α基因对血管生成拟态相关基因表达的影响

论文摘要

目的:利用RNA干扰技术沉默HIF-1α基因,构建稳定表达沉默HIF-1α的食管鳞癌Eca-109细胞株,分别常氧、缺氧条件下研究RNA干扰对人食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因及血管生成拟态相关基因的抑制效应。方法:1、用不同缺氧时间（0、12、24、36、48、60、72、96h）分别缺氧培养食管鳞癌细胞Eca-109（缺氧培养箱中混合气体浓度为5%CO2、85%N2、10%H2）,以Western blotting法检测细胞中HIF-1α蛋白的表达变化,选择可以引起HIF-1α蛋白表达增加的适当的缺氧培养时间。2、选择四组细胞进行培养:1组为食管鳞癌细胞Eca-109,2～4组为RNA干扰HIF-1α基因后筛选出的稳定传代的3株细胞（分别为H2/20、H3/10、H3/15号细胞,由本实验室编号保存）,采用缺氧培养24h,以Western blotting和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α蛋白及mRNA表达,同时Western blotting检测上皮细胞激酶（EphA2）、血管上皮钙粘附素（VE-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、层粘连蛋白5γ2链（LN-5γ2）等血管生成拟态相关基因的表达。结果:一、HIF-1αmRNA及蛋白的表达在常氧和缺氧不同时间点检测Eca109细胞HIF-1α的表达,发现HIF-1αmRNA表达无明显差异（P＞0.05）（图一、二）。Eca109细胞和干扰处理的各组细胞在常氧和缺氧培养24小时后检测,各组细胞HIF-1αmRNA表达无明显差异（P＞0.05）（图三、四）。在Eca-109细胞中HIF-1α蛋白表达在缺氧处理时较常氧培养时增加,在缺氧后24-48h明显升高,60h略有降低,72-96h逐渐减少（图五）。3组RNA干扰的细胞常氧下HIF-1α蛋白表达被明显抑制,且在缺氧处理后亦无明显递增趋势（图六）。二、血管生成拟态相关基因的表达干扰细胞常氧下EphA2、LN5γ2表达比未干扰的Eca-109细胞明显减少,缺氧处理24h后亦无明显增加（图七）;VE-cadherin、MMP-2表达较未干扰细胞略减少,缺氧处理后表达稍增强（P＞0.05）（图八、九、十）。结论:1、HIF-1α蛋白表达与缺氧时间有关,HIF-1αmRNA表达没有明显差异,提示缺氧诱导的HIF-1α调节可能发生在蛋白水平,而非转录水平。2、所选3株细胞干扰效率均较高,干扰后HIF-1α蛋白表达明显抑制,且缺氧后亦无明显增强。说明RNA干扰作为一种特异性基因沉默技术,具有更好的稳定性和更优越的抑制效果,是基因功能研究的得力工具。3、VE-cadherin、EphA2、Ln-5γ2及MMP-2等均是与血管生成拟态关系密切的基因。本研究中,食管癌细胞HIF-1α被抑制后EphA2、Ln-5γ2的表达也明显下调,且缺氧处理24h后亦无明显增加,VE-cadherin、MMP-2表达较未干扰细胞略减少,缺氧处理24h后表达稍增强。提示抑制HIF-1α后可能通过抑制EphA2与Ln-5γ2的表达而抑制血管生成拟态的形成。

论文目录

• 一、英文缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、论文正文
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 五、参考文献
• 六、致谢
• 七、综述与参考文献