酿酒酵母Zds1/Sch9在Ras-cAMP信号通路中的功能研究

论文摘要

Ras/cAMP信号通路中,Sch9/Zds1的功能对调节酵母细胞PKA活性乃至热激抗性以及其调节亚基Bcy1的定位具有重要作用,同时Bcy1的定位也与碳源类型密切相关。研究不同碳源条件下Sch9/Zds1如何共同作用实现对PKA活性以及Bcy1定位的调控,将有助于酿酒酵母信号通路的研究,同时为高等真核生物的信号通路研究提供借鉴。本研究表明,正常PKA水平的菌株中过量表达ZDS1可使PKA水平降低,而低PKA表型的菌株中过量表达ZDS1可使PKA水平升高。这说明酵母细胞可能通过Zds1响应不同的PKA表型从而自我调节PKA的水平。不同碳源条件下,与野生型相比,zds1Δ突变株和sch9Δ突变株中,Bcy1均由细胞质向细胞核转移。野生型和sch9Δ突变株中过量表达ZDS1可使Bcy1由细胞核向细胞质转移。野生型细胞中过量表达SCH9可使Bcy1由细胞核向细胞质转移,但zds1Δ突变株中过量表达SCH9不能使Bcy1由细胞核向细胞质转移。这说明Sch9可能作用于Zds1的上游对Bcy1的定位进行调控。通过比对热激结果与荧光结果,发现两部分结果之间存在着共同的趋势,推测PKA的活性可能与Bcy1的定位之间存在着直接关系。研究中还发现,部分正在进行出芽生殖过程的细胞中,Zds1在芽颈处大量聚集,而且碳源的差异也没有造成明显的区别。这表明,Zds1可能在酿酒酵母出芽生殖的过程中起着重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 G 蛋白与细胞信号转导
• 1.2 RAS 基因及其蛋白产物
• 1.3 cAMP 信号通路的组成及作用
• 1.4 酿酒酵母cAMP 信号转导通路
• 1.4.1 G 蛋白偶联的受体体系（Gpr1-Gpa2）
• 1.4.2 Ras-cAMP 信号通路组成
• 1.4.3 cAMP 途径的主要靶标--cAMP 依赖的蛋白激酶PKA
• 1.4.4 PKA 调节亚基Bcy1 的细胞定位
• 1.4.4.1 信号转导通路的区位划分
• 1.4.4.2 Zds1 与Bcy1 定位之间的相互作用关系研究进展
• 1.5 FGM 信号通路及其主要作用元件
• 1.5.1 Sch9 和PKA 的相互作用关系
• 1.6 cAMP-PKA 途径与胁迫响应之间的关系
• 1.7 本论文的研究思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株与引物
• 2.1.1.1 质粒
• 2.1.1.2 菌株
• 2.1.1.3 引物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2 法'>2.2.1.1 CaCl₂法
• 2.2.1.2 电转化法
• 2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB 法）
• 2.2.3 酵母染色体的快速分离
• 2.2.4 PCR 扩增反应
• 2.2.5 DNA 的限制酶消化
• 2.2.6 DNA 的连接反应
• 2.2.7 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.8 从琼脂糖中回收DNA
• 2.2.9 酵母细胞的转化方法
• 2.2.10 酵母中质粒的回收
• 2.2.11 酵母交配型的验证
• 2.2.12 不同交配型酵母细胞之间的杂交
• 2.2.13 产孢及四分体孢子拆分
• 2.2.14 Dilution 实验方法
• 2.2.15 热击实验方法
• 2.2.15.1 水浴热击
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 Zds1/Sch9 对PKA 活性表型的影响
• 3.1.1 SCH9 基因的缺失
• 3.1.2 ZDS1 基因的缺失
• 3.1.3 SCH9 和ZDS1 基因的双缺失
• 3.1.4 质粒YEplac195-ZDS1 的构建
• 3.1.5 Zds1/Sch9 对PKA 活性表型的协同作用
• 3.2 Zds1/Sch9 对PKA 调节亚基Bcy1 定位的调控
• 3.2.1 质粒YEplac181-SCH9 的构建
• 3.2.2 质粒YCplac22-GFP-BCY1 的构建
• 3.2.3 质粒YEplac181-ZDS1-GFP 的构建
• 3.2.4 缺失SCH9 对Bcy1 定位的影响
• 3.2.5 缺失ZDS1 对Bcy1 定位的影响
• 3.2.6 过量表达SCH9 以及过量表达ZDS1 对Bcy1 定位的影响
• 3.2.7 SCH9 和ZDS1 双缺失对Bcy1 定位的影响
• 3.2.8 Zds1 在细胞内定位情况的初探
• 3.3 Bcy1 的定位与PKA 活性之间的关系推测
• 第四章 总结与展望
• 4.1 主要工作总结
• 4.2 相关工作展望
• 参考文献
• 致谢