狐源CDV H、F、N基因序列分析及其TaqMan荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

论文摘要

为进一步研究犬瘟热病毒的防控与诊断,本研究采用分子生物学技术,分别设计合成了扩增CDV H基因、F基因和N基因的三对引物。采用RT-PCR分别扩增了狐源CDV泰安株（CDV-FOX-TA）的H基因、F基因和N基因,并将其分别克隆进pMD18-T载体,进行序列测定与分析。此外本研究还设计合成了一对特异性引物与TaqMan探针,对反应体系与条件进行优化,建立一种TaqMan荧光定量RT-PCR检测CDV的方法,试验结果表明:1.CDV-FOX-TA H基因含有1个ORF,全长1824bp,共编码607个氨基酸,与CDV-A75/17株和部分野毒株编码的氨基酸数量相同,与CDV- Onderstpoort编码的604个氨基酸不同。CDV-FOX-TA H基因终止密码子不是AUU而是UGA。其上存在8个潜在的天冬酰氨糖基化位点,与野毒株和疫苗株均不同,与CDV-Onderstpoort、CDV-Convac、CDV-A75/17、CDV-LP的同源性分别为89.2%、90.6%、98.6%和98.7%。2.CDV-FOX-TA的F基因含有1个ORF,全长1889bp,共编码662个氨基酸。有4个翻译起始密码子,其中3个位于阅读框内,1个位于阅读框外, CDV-FOX-TA F基因翻译起始密码子不是第1个或第2框内ATG,因其461-463位置不是ATG而是AUA,而是可能利用与CDV-A75/17相同的第二个起始密码子,因为CDV-FOX-TA这一区域的核苷酸与CDV-A75/17是完全保守的。CDV各毒株的F基因存在较大的差异,信号肽区域变异很大,但是F0蛋白裂解点（RRQRR）、13个半胱氨酸残基、4个潜在的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区都高度保守。3.CDV-FOX-TA N基因含有1个ORF,全长1572bp,共编码523个氨基酸,编码的氨基酸序列可以分为三个区:N端可变区、C端可变区和中间高度保守区。CDV-FOX-TA N基因与CDV-Onderstepoort、CDV-Convac的N基因的同源性分别为96.0%和95.9%,与野毒的同源性介于98.4%-98.9%之间。CDV-FOX-TA与弱毒的差异主要表现在C端和N端,中间区域高度保守。4.建立的CDV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,具有高度特异性、敏感性、良好的可重复性和稳定性、而且简便、快速。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 犬瘟热研究概况
• 1.1 病原
• 1.2 致病机理
• 1.3 流行病学
• 1.4 临床症状
• 1.5 病理变化
• 1.6 诊断学
• 1.7 防治
• 2 犬瘟热病毒分子生物学特征
• 2.1 形态学和基因特征
• 2.2 病毒蛋白
• 2.2.1 前导序列及其调控序列
• 2.2.2 核衣壳蛋白（N）蛋白及其基因
• 2.2.3 磷（P）蛋白及其基因
• 2.2.4 基质膜（M）蛋白及其基因
• 2.2.5 大（L）蛋白及其基因
• 2.2.6 融合（F）蛋白及其基因
• 2.2.7 附着或血凝（H）蛋白及其基因
• 2.3 抗原变异性
• 3 实时荧光定量PCR 研究进展
• 3.1 实时定量 PCR 原理
• 3.2 实时定量 PCR 分类
• 3.2.1 非探针类
• 3.2.2 探针类
• 3.2.3 Amplisensor 技术
• 3.2.4 分子信标
• 3.2.5 LightCycler
• 3.2.6 复合探针法
• 3.3 实时荧光定量 PCR 的特点及优点
• 3.4 实时荧光定量 PCR 的应用
• 3.4.1 核酸浓度的定量
• 3.4.2 环境检测
• 3.4.3 转基因生物中的应用
• 3.4.4 基因转录的检测
• 3.4.5 生物分类和植物病原物检测
• 3.4.6 医学应用
• 3.5 在兽医学研究领域的应用
• 3.5.1 在细菌病诊断中的应用
• 3.5.2 在病毒病诊断中的应用
• 3.5.3 在寄生虫病诊断中的应用
• 3.5.4 在其他方面的应用
• 3.6 实时荧光定量 PCR 的展望
• 实验一 CDV-FOX-TA H、F和N基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.3 引物的设计与合成
• 1.4 常规DNA 操作技术
• 1.4.1 大肠杆菌感受态的制备
• 1.4.2 连接物的转化
• 1.4.3 转化菌落的快速鉴定
• 1.4.4 重组子的酶切筛选与鉴定
• 1.4.5 质粒的小量制备
• 1.4.6 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 1.4.7 目的片段回收
• 1.4.8 外源DNA 片段与质粒载体的连接反应
• 1.4.9 限制性内切酶水解反应
• 1.5 病毒总RNA 的提取
• 1.6 RT-PCR
• 1.7 H、F 和 N 基因的克隆与序列分析
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR 扩增结果
• 2.2 CDV-FOX-TA H、F 和N 基因重组质粒的鉴定
• 2.3 同源性分析及系统发生树的构建
• 3 讨论
• 实验二 TaqMan荧光定量RT-PCR检测CDV方法的建立与初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 CDV 总RNA 的提取
• 1.2.3 反转录及其反应条件的优化
• 1.2.4 RT-PCR 反应体系的建立及反应条件的优化
• 1.2.5 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 标准阳性模板的制备
• 1.2.6 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 反应体系的建立及反应条件的优化
• 1.2.7 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 方法特异性试验
• 1.2.8 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 方法敏感性试验
• 1.2.9 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 方法重复性试验及标准曲线的建立
• 1.2.10 犬瘟热病毒 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 检测方法的初步应用
• 2 结果
• 2.1 反转录反应条件的优化结果
• 2.2 RT-PCR 反应体系与反应条件
• 2.3 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 反应体系及反应条件
• 2.4 特异性试验结果
• 2.5 敏感性实验结果
• 2.6 重复性试验结果与标准曲线
• 2.7 犬瘟热病毒 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 检测方法的初步应用结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士期间发表的部分论文
• 附录