mTORC1活化上调LDHB表达在肝癌发生中的作用及机理研究

论文摘要

背景在肿瘤的发生发展中，信号传导通路的异常激活非常常见。RTKs-PI3K-AKT-mTORC1信号传递通路控制细胞生长、增殖、存活和分化中起着重要作用。其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTORC1）是一种受体酪氨酸激酶效应的主要下游信号途径。mTORC1是细胞生长和增殖的关键调节分子，受营养及能量信号的控制且对雷帕霉素（rapamycin）敏感。近年来，不断有研究表明哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物1（mTORC1）活化及其下游信号通路的激活在肝癌的发生发展中起到非常重要的作用。但mTORC1异常活化导致肿瘤发生的具体机制至今仍不甚清楚。近年来，有研究发现LDHB在肺癌和睾丸生殖细胞肿瘤中显著上调，提示LDHB很可能参与了这些肿瘤的发生发展过程。体外实验结果显示在敲除TSC1/TSC2后，细胞中LDHB表达明显升高，并且在TSC1/2-mTORC1通路活化导致的肿瘤发生中LDHB起重要的作用；并且mTORC1活化是可能通过激活STAT3来上调LDHB的表达来实现的。因此，LDHB作为下游基因在mTORC1信号通路调节下，对肝癌发生、发展等各项生物学行为的具体影响，以及在肝癌细胞中mTORC1活化上调LDHB的具体机制需进一步研究。目的本研究主要探讨LDHB作为下游基因在mTORC1信号通路调节下，对肝癌发生、发展等各项生物学行为的影响，并进一步探索在肝癌细胞中，mTORC1活化上调LDHB表达的作用和具体机制。方法通过免疫组织化学染色和Western blot方法检测肝癌组织和癌旁组织中mTORC1和LDHB的表达及其相关性。利用mTOR特异性抑制剂rapamycin处理肝癌细胞系HepG2和SK-HeP1；利用特异性siRNA在肝癌细胞系HepG2和SK-HeP1中敲低mTOR，mTORC1特有的亚单位Raptor；用RT-PCR和Western blot方法检测LDHB的表达情况。用STAT3的特异性抑制剂AG490处理了肝癌细胞系HepG2和SK-HeP1，Western blot检测抑制STAT3活性后能否显著降低LDHB的蛋白表达水平。进一步检测，转染STAT3的特异性siRNA能否降低肝癌细胞系HepG2和SK-HeP1中LDHB的表达。MTT法测定过表达或敲低LDHB对肝癌细胞系HepG2和SK-HeP1的增殖的影响。结果在75例肝细胞癌标本中p-S6和LDHB的阳性表达率分别为80％和74.70％，癌旁组织中p-S6和LDHB的阳性表达率分别为46.7％和40％，肝癌组织中p-S6和LDHB表达明显高于癌旁组织（P<0.05）。p-S6和LDHB的表达均与肿瘤的分化程度，门静脉栓塞有关（P<0．05），与肿瘤直径、性别和年龄无明显关系。p-S6和LDHB的表达有显著相关性（r=0.238，P<0．05）. Western blot分析表明肝癌组织LDHB表达升高，并且LDHB的表达水平与肝癌组织中mTORC1的活性（以p-mTOR表达水平为依据）有明显相关性；使用RT-PCR和western blot检测sk-hep1和hepG2肝癌细胞中，rapamycin处理和siRNA敲低mTOR、Raptor抑制LDHB表达，结果显示LDHB表达及其LDHB的mRNA的表达明显降低；进一步使用STAT3的抑制剂AG490和siRNA敲低sk-hep1和hepG2肝癌细胞株中的STAT3后，免疫印迹检测结果显示LDHB的表达明显降低；MTT检测结果显示敲低LDHB，能显著抑制sk-hep1和hepG2肝癌细胞的增殖。结论本研究发现LDHB在肝细胞癌组织中高表达，mTORC1通路活化引起的LDHB高表达在肝细胞癌发生发展中起重要的作用；mTORC1活化上调LDHB的表达通过激活STAT3来实现的。最后发现LDHB可能是mTORC1/STAT3通路下游基因，为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点。

论文目录

• 英文缩略简表
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 一.肝癌组织中 LDHB 表达升高
• 二.在 sk-hep1 和 hepG2 肝癌细胞中，rapamycin 处理和 siRNA 敲低mTOR、 Raptor 后都能抑制 LDHB 的表达
• 三.mTOR 上调 LDHB 的表达是通过 stat3。 stat3 的抑制剂 AG490 和siRNA 处理 sk-hep1 和 hepG2 肝癌细胞系中 STAT3 能降低 LDHB 的表达
• 四.敲低 LDHB，抑制 sk-hep1 和 hepG2 肝癌细胞的增殖
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 文献综述
• 参考文献