齐墩果酸抗糖尿病作用及其机理研究

论文摘要

糖尿病是世界范围内最常见的内分泌性疾病之一,其死亡率在发达国家仅次于心血管疾病、恶性肿瘤,成为第三位致死病因疾病。WHO调查材料显示,目前全世界至少有1.71亿糖尿病患者,预测到2030年将增至3.66亿,其发病率也将由目前的2.8%上升为4.4%。尽管有大量的降血糖药物在临床应用,但由于其副作用大、使用不便,疗效不稳定,目前仍未发现一种有效的治疗药物。胰岛素虽然是人类发现的有效降糖药物,但它只能缓解患者血糖的升高,并不能达到完全治愈的目的。天然抗糖尿病药物以其毒副作用小和不易产生耐药性普遍受到医学界的关注,西方发达国家正在加快天然药物开发,不断有源于天然产物的新药问世。女贞子是我国传统的中药,通常用来治疗癌症、肝炎等疾病。在降血糖研究中,尽管也有少量报道,但仍然缺乏较为系统的深入研究。有关女贞子治疗糖尿病的机理方面目前国际上仍未见相关的报道。本研究采用多重结晶技术从植物女贞子中提取出活性物质——齐墩果酸（OA）,通过分离、纯化,薄层色谱和质谱鉴定,进一步将其磨成粒径为200-700nm的粉末。以腹腔注射链尿佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（Alloxan）构建大鼠和小鼠糖尿病模型,将其分为糖尿病对照组、齐墩果酸低剂量、高剂量治疗组和正常对照组。采用免疫组化、单细胞电泳、酶联免疫吸附、免疫印迹和RT-PCR等技术研究了齐墩果酸对糖类和脂类代谢相关基因PPARα、PPARγ、PKB和PKC的表达变化,以及对糖尿病鼠β细胞凋亡、抗氧化能力和糖代谢相关激素水平的影响,并获得如下研究结果。糖尿病大鼠经OA处理40 d后,低、高剂量组血糖分别下降了32.4%和46.4%;高剂量治疗组TG、TC、LDL-c水平明显下降,HDL-c水平则升高（P <0.05, 0.01）,表明其具有显著的降脂功能。治疗组大鼠血清ALP、AST和ALT水平均接近于正常,揭示OA对肝脏具有明显的保护作用。此外,OA也升高了SOD和GSH-px水平（P <0.05, 0.01）,增强了机体的抗氧化能力。采用HE染色、急毒性试验和单细胞电泳技术（SCGE）对OA的毒副作用进行检测,结果表明,OA能使胰岛数量及胰岛内细胞数量增加;同时它能够修复STZ诱导的糖尿病鼠的肝和肾的损伤。在急毒性试验中,小鼠灌服OA 1000 mg·kg-1剂量时,未见出现死亡。SCGE结果揭示,OA对淋巴细胞的DNA没有损伤。通过对糖尿病大鼠胰岛素和甲状腺素水平分析表明,OA能够明显增加糖尿病大鼠的胰岛素分泌（P <0.05）,但对血清T3、T4和TSH水平没有明显影响。此外,OA对糖尿病大鼠的肝脏、肺、胰腺和肾脏等器官的重量没有明显影响,但能够显著增加胸腺的重量（P <0.05）,这可能是OA通过作用于胸腺而增强机体的免疫功能。通过对细胞凋亡影响的研究表明,OA处理后,小鼠胰腺、肾组织的Bax mRNA表达均减少,而Bcl-2表达增加,Bcl-2/Bax比值接近正常对照组,与糖尿病组存在明显差异（P <0.05, 0.01）。说明OA对胰腺和肾脏细胞的凋亡可能具有明显的抑制作用。免疫组化分析表明,OA也改善了肝脏中Bax和Bcl-2蛋白的表达,恢复肝细胞的正常的糖、脂代谢功能,避免糖尿病并发症的发生。通过对细胞因子的表达进行分析,结果表明经OA治疗8 w后,糖尿病鼠的PPARα表达上调,但与对照组没有明显的不同（P >0.05）;OA明显刺激了胰腺、肾脏PPARγmRNA的表达水平（P <0.05）。通过Westhern Blot分析表明,OA治疗的糖尿病鼠肾组织中PKB蛋白含量明显增加（P <0.05）。这些结果揭示OA降血糖和血脂作用可能是通过PKB/PPAR途径完成,即OA刺激胰岛素分泌,修复肝、肾和胰腺的损伤,而发挥作用。此外,OA对肝、肾组织PKC的表达未发生显著影响（P >0.05）。本文较系统地研究了女贞子提取物——齐墩果酸对糖尿病鼠的治疗作用,并从糖类和脂类相关激素和基因水平初步探讨了其作用机制。该研究为OA降糖作用与机理的进一步深入研究提供了科学依据和手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 选题背景
• 1.2 糖尿病治疗现状
• 1.2.1 降血糖西药
• 1.2.2 降血糖中药
• 1.2.3 女贞子药学作用研究现状
• 1.3 糖尿病发病机理的研究进展
• 1.3.1 氧化应激作用
• 1.3.2 DAG/PKC 信号通路
• 1.3.3 PKB/Akt 对糖尿病的代谢调控
• 1.3.4 PPARα和PPARγ对糖尿病的影响
• 1.3.5 细胞凋亡理论
• 1.4 本文的主要研究内容和意义
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 研究意义
• 第2章 女贞子中齐墩果酸的提取和鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 女贞子中齐墩果酸的提取
• 2.2.2 齐墩果酸的鉴定
• 2.2.3 齐墩果酸微米粉制备
• 2.2.4 齐墩果酸微米粉的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 女贞子中齐墩果酸的提取
• 2.3.2 女贞子中齐墩果酸的鉴定
• 2.3.3 齐墩果酸微米粉制备
• 2.3.4 齐墩果酸微米粉鉴定
• 2.3.5 齐墩果酸微米粉溶解度比较
• 2.4 讨论
• 2.4.1 女贞子中齐墩果酸的提取
• 2.4.2 女贞子中齐墩果酸的鉴定
• 2.4.3 齐墩果酸微米粉的鉴定
• 2.5 本章小结
• 第3章 齐墩果酸对糖尿病大鼠氧化防御系统的影响
• 3.1 材料
• 3.1.1 药品和试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 糖尿病大鼠模型的建立
• 3.2.2 糖尿病大鼠血糖的测定
• 3.2.3 糖尿病大鼠血脂及其它生化指标的测定
• 3.2.4 糖尿病大鼠肝、肾组织抗氧化能力的测定
• 3.2.5 齐墩果酸的毒副作用测定
• 3.2.6 数据统计
• 3.3 结果
• 3.3.1 糖尿病大鼠模型的建立与评价
• 3.3.2 齐墩果酸对糖尿病大鼠血糖的作用
• 3.3.3 齐墩果酸对糖尿病大鼠血脂的作用
• 3.3.4 齐墩果酸对糖尿病鼠 ALT, AST 和 ALP 水平的影响
• 3.3.5 齐墩果酸对糖尿病大鼠肝、肾组织抗氧化能力的影响
• 3.3.6 齐墩果酸的毒副作用
• 3.4 讨论
• 3.4.1 糖尿病大鼠模型的建立与评价
• 3.4.2 齐墩果酸对糖尿病鼠血糖作用的评价
• 3.4.3 齐墩果酸对血脂的作用
• 3.4.4 齐墩果酸对糖尿病鼠AST,ALT 和ALP 水平的作用
• 3.4.5 齐墩果酸对糖尿病鼠抗氧化能力的影响
• 3.4.6 齐墩果酸的毒性试验
• 3.5 本章小结
• 第4章 齐墩果酸的降糖效果及其对胰岛素和甲状腺素水平的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 药品和试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 试验动物
• 4.1.4 主要试剂配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 糖尿病大鼠模型的建立与动物分组
• 4.2.2 试验大鼠血糖的测定
• 4.2.3 试验大鼠血脂的测定
• 4.2.4 试验大鼠体重的测定
• 4.2.5 试验大鼠器官重量的测定
• 4.2.6 试验大鼠血清胰岛素水平的测定
• 4.2.7 试验大鼠血清甲状腺素水平的测定
• 4.2.8 数据统计
• 4.3 结果
• 4.3.1 齐墩果酸对试验大鼠血糖的影响
• 4.3.2 各组试验大鼠血脂的变化
• 4.3.3 试验大鼠体重的测定结果
• 4.3.4 各试验组大鼠器官重量的变化
• 4.3.5 各试验组大鼠血清胰岛素水平的变化
• 4.3.6 各试验组大鼠血清甲状腺素和促甲状腺素水平的变化
• 4.4 讨论
• 4.4.1 齐墩果酸对糖尿病大鼠的降血糖作用
• 4.4.2 齐墩果酸对糖尿病大鼠体重的作用
• 4.4.3 齐墩果酸对糖尿病大鼠的降血脂效果
• 4.4.4 齐墩果酸对糖尿病大鼠器官重量的影响
• 4.4.5 齐墩果酸对糖尿病大鼠甲状腺素水平的影响
• 4.4.6 齐墩果酸对糖尿病大鼠胰岛素水平的影响
• 4.5 本章小结
• 第5章 齐墩果酸对细胞凋亡影响的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 试验动物
• 5.1.2 试剂和药品
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 溶液配制
• 5.2 方法
• 5.2.1 糖尿病小鼠模型的构建
• 5.2.2 动物分组及血糖试验
• 5.2.3 胰腺和肾组织总RNA 的提取
• 5.2.4 RNA 的纯度和浓度检测
• 5.2.5 RNA 逆转录为cDNA
• 5.2.6 试验鼠的胰腺、肾脏Bax 和Bcl-2 表达量检测
• 5.2.7 肝组织中Bax 和Bcl-2 表达量的测定
• 5.2.8 数据统计
• 5.3 结果
• 5.3.1 齐墩果酸对糖尿病小鼠血糖的影响
• 5.3.2 胰腺、肾组织总RNA 提取及其纯度鉴定
• 5.3.3 试验鼠肾脏中Bax 和Bcl-2 的表达
• 5.3.4 试验鼠胰腺组织中Bax 和Bcl-2 的表达
• 5.3.5 试验鼠肝脏组织中Bax 和Bcl-2 的表达
• 5.4 讨论
• 5.4.1 齐墩果酸对糖尿病鼠血糖的影响
• 5.4.2 齐墩果酸对糖尿病鼠肾组织细胞凋亡的影响
• 5.4.3 齐墩果酸对糖尿病鼠胰腺组织细胞凋亡的影响
• 5.4.4 齐墩果酸对糖尿病鼠肝组织细胞凋亡的作用
• 5.5 本章小结
• 第6章 齐墩果酸对糖和脂类代谢相关因子的影响
• 6.1 材料
• 6.1.1 试验动物
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要仪器
• 6.1.4 试剂配制
• 6.2 方法
• 6.2.1 试验样品的获得
• 6.2.2 提取试验鼠肝、肾组织总RNA 及其鉴定
• 6.2.3 组织样品cDNA 的获得
• 6.2.4 肝、肾组织总蛋白质的提取及含量测定
• 6.2.5 肝、肾组织中PPARα，PPARγ表达的测定
• 6.2.6 齐墩果酸对肾组织中PKB 表达影响的测定
• 6.2.7 试验鼠肾组织中PKC 表达的测定
• 6.2.8 数据统计
• 6.3 结果
• 6.3.1 肝和肾组织中PPARα的表达量
• 6.3.2 试验鼠肝、肾组织中PPARγ表达量
• 6.3.3 试验鼠肾组织中PKB 的表达量
• 6.3.4 试验鼠肾组织中PKC 表达量
• 6.4 讨论
• 6.4.1 齐墩果酸对糖尿病鼠肝和肾组织中PPARα、PPARγ表达的影响
• 6.4.2 齐墩果酸对糖尿病鼠肾组织中PKB 表达的影响
• 6.4.3 齐墩果酸对糖尿病鼠肾组织中PKC 表达的影响
• 6.5 本章小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读博士学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 作者简介