利用德氏保加利亚乳杆菌发酵脱脂乳生产生物活性肽及其体外生理功能初步研究

论文摘要

乳源生物活性肽是一类由2-20aa组成的短肽段,它能对机体健康产生积极影响,例如,抗高血压、免疫调节、抗氧化等。这些短肽通常隐匿在母体蛋白中,需要通过微生物发酵或蛋白酶水解的方式释放后,才能发挥相应的活性。但发酵产物和酶水解产物成份非常复杂,所以从其中分离纯化得到这些活性非常困难。因此,全面评价益生菌的发酵乳制品的产肽组分的体外生理活性,对衡量发酵乳制品的营养价值提升具有重要的意义。本文利用德氏保加利亚乳杆菌LB340 LYO,对脱脂乳进行了发酵,从发酵工艺的优化、小肽组分的分离纯化和体外生理功效评价等方面进行了探讨,为利用德氏保加利亚乳杆菌LB340 LYO生产功能肽乳制品奠定了基础。主要研究结果如下:1)根据目标小肽的来源和分子量分布对小肽浓度测定的标准物进行筛选,最终确定酪蛋白的胃蛋白酶水解产物Peptone为最适标准物,建立了乳源小肽的浓度相对准确的测定方法:Peptone-Folin酚法。其标准曲线方程为Y=0.48158X,其中Y为吸光值,X为混合小肽浓度。线性相关系数R=0.99936,说明结果具有很好的相关性,可用于样品浓度的测定。2)以产肽量和目标区段小肽丰度为指标,从菌种配比、发酵时间和后熟工艺三个方面对德氏保加利亚乳杆菌LB340 LYO发酵工艺进行了优化,最后确定其最佳产肽条件为:单一LB340 LYO菌株,42°C培养16h,不采用后熟工艺。3)利用离心、超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱对发酵产物中的小肽组分分别进行了分离与纯化,获得的≤1kDa的小肽的组分的浓度为3.655μg/μL。对1kDa样品进一步凝胶层析分离,获得F1-F6六个组分峰,其中F2组分表现出最高的ACE抑制活性,其半抑制浓度为67.79μg/μL。通过RP-HPLC对F2进一步分离,得到四个组分F2-1、F2-2、F2-3和F2-4。在2μg/mL的浓度下均表现出良好的ACE抑制活性,其抑制率为22.19%、24.35%、21.66%和18.77%。MTT实验表明,≤1kDa超滤液对小鼠淋巴细胞增殖有正向刺激作用,进一步分离得到得F1、F3、F4、F6组分能够刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,其刺激指数（SI）分别为0.014、0.096、0.646和0.729。然而,F5组分具有明显的负调控影响,表明样品具有一定的抗超敏反应作用。此外这些按分子量分级超滤分离样品的抗氧化实验结果表明,各级超滤液都能够清除[DPPH*]自由基,其中作用最高的为5kDa超滤产物,自由基清除率达65.98%,显著高于其他组分。FRAP分析表明相同样品也具有一定的还原力,但未见其与抗氧化能力之间有明显的相关性,这可能有它们的反应原理差异有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 乳源性生物活性肽的生产与功能研究进展
• 1 概述
• 2 生物活性肽的生产
• 2.1 利用蛋白酶水解生产生物活性肽
• 2.2 利用益生菌发酵生产生物活性肽
• 2.3 利用益生菌分泌的蛋白酶水解生产生物活性肽
• 3 生物活性肽的分离与富集
• 4 生物活性肽的功能
• 4.1 胃肠道系统功能调节
• 4.2 神经系统调节作用
• 4.3 心血管系统调节作用
• 4.4 免疫系统调节作用
• 4.5 生物活性肽的其它功能
• 5 乳制品中的生物活性肽
• 5.1 干酪制品中的生物活性肽状况
• 5.2 流态型发酵乳制品中生物活性肽状况
• 6 展望
• 参考文献
• 本课题立题依据和意义
• 第二章 乳源性小肽浓度测定方法的选择
• 1 材料与方法
• 1.1 酶及生物化学试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 传统的Folin‐酚蛋白浓度标准曲线的制作
• 1.4 改良的Folin‐酚多肽浓度标准曲线的制作
• 1.5 Superdex 30 prep grade 凝胶层析判断标准物的分子量分布
• 2 结果与讨论
• 2.1 三种标准物的Folin‐酚吸光测定结果
• 2.2 标准曲线的筛选
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 徳氏保加利亚乳杆菌发酵产肽的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 脱脂乳的配制
• 1.2.2 乳蛋白水解工艺实验设计
• 1.2.3 发酵乳样品的预处理
• 1.2.4 Peptone‐Folin‐酚法测定小肽浓度
• 1.2.5 凝胶层析法测定发酵乳样品中小肽分子量分布
• 2 结果与讨论
• 2.1 发酵乳感官评定
• 2.2 不同培养时间的发酵产物分析
• 2.2.1 pH 检测
• 2.2.2 Peptone‐Folin‐酚法测定发酵产物小肽浓度
• 2.2.3 凝胶层析法测定发酵小肽丰度
• 2.3 不同菌种（或复配比例）的发酵产物分析
• 2.3.1 pH 检测
• 2.3.2 Peptone‐Folin‐酚法测定发酵产物小肽浓度
• 2.3.3 凝胶层析法测定发酵小肽丰度
• 2.4 后熟处理对发酵产物的影响
• 2.4.1 pH 检测
• 2.4.2 Peptone‐Folin‐酚法测定后熟产物小肽浓度
• 2.4.3 凝胶层析法测定后熟产物小肽丰度
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 乳源小肽的分离纯化与体外活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 发酵菌株与实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 方法
• 1.4.1 发酵产物的制备及分离纯化
• 1.4.2 LB340 LYO 发酵产物体外抑制ACE 活性实验
• 1.4.3 LB340 LYO 发酵产物体外刺激淋巴细胞增殖实验
• 1.4.4 LB340 LYO发酵产物体外抗氧化作用实验
• 1.4.5 LB340 LYO 发酵产物体外还原力测试实验
• 1.5 统计分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 发酵产物的粗提与纯化
• 2.1.1 分级超滤
• 2.1.2 凝胶层析分离产物
• 2.1.3 RP‐HPLC 分离产物
• 2.2 样品体外ACE 抑制活性分析
• 2.2.1 HA 浓度与面积标准曲线
• 2.2.2 ACE 提取物的酶活测定
• 2.2.3 ACE 体外抑制实验
• 2.3 LB340 LYO 发酵产物体外刺激淋巴细胞增殖实验结果
• 2.3.1 超滤液样品对小鼠脾脏淋巴细胞的作用
• 2.3.2 ≤1kDa 的小肽组分凝胶层析样品对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响
• 2.4 LB340 LYO 发酵产物体外抗氧化实验结果
• 3 本章小结
• 参考文献
• 结论与展望
• 致谢
• 硕士学位期间发表学术论文