低密度脂蛋白、大豆卵磷脂和海藻糖对猪精液冷冻保存效果的影响

论文摘要

猪精液冷冻保存技术可以有效加快动物的遗传选择,减少自然交配中的传染性疾病传播并提高雄性动物的种用价值和利用率,便于国际间优良种质杂交遴选。虽经过多年研究,但至今仍没有在生产中广泛应用,其主要原因在于猪精子对极端刺激耐受性不强,冷冻中极易受到伤害,加之猪的多胎性繁殖,使用冷冻精液进行的繁育其发情期受胎率、产仔率普遍低于自然交配和鲜精受胎,造成猪冷冻精液很难推广使用,目前猪冷冻精液的研究仍处于试验阶段。在冷冻过程中添加冷冻保护剂可以有效的增强猪精子抗低温打击的能力,提高精子冻融后活率、顶体完整性和质膜完整性。本论文主要研究卵黄低密度脂蛋白（Low Density Lipolipid, LDL）、大豆卵磷脂（Soybean lecithin）和海藻糖（Trehalose）三种冷冻保护剂对猪精子的冷冻保护作用,以对猪精液冷冻保存研究提供参考,并对三种保护剂对猪精子防止冷冻伤害的机理进行了初步探讨。本研究主要获得以下结果:1、为确定有最佳抗冷冻效果的禽类卵黄LDL及其添加浓度,本研究在猪精液冷冻稀释液中分别添加质量分数为0.06、0.07、0.08、0.09和0.1g/mL的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子和鸵鸟的卵黄LDL,分析不同LDL对猪精子的冷冻保存效果。结果表明:稀释液中添加0.09 g/mL的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子卵黄LDL以及0.08g/mL的鸵鸟卵黄LDL时,冻融后精子活率最高,分别达到40.33%、35.63%、31.47%、43.33%和36.40%。以五种禽类LDL最佳浓度配制冷冻稀释液冷冻精子,发现0.09g/mL的鸽蛋LDL冻存猪精子时解冻后精子活率为43.20%,顶体完整性为52.57%,质膜完整性为48.13%,均显著优于其他处理组（P<0.05）。表明鸽子卵黄LDL对猪精子具有良好的冷冻保护性能,可提高猪精子抵抗低温打击的能力。2、近几年来猪精液冷冻保护剂的研究主要集中寻找效果优异的非渗透性冷冻保护剂上,海藻糖和大豆卵磷脂是研究最为集中的两种非渗透性保护剂。本研究在冷冻稀释液基础上,分别用具有浓度梯度的鸽蛋LDL+大豆卵磷脂、鸽蛋LDL+海藻糖、大豆卵磷脂+海藻糖和鸽蛋LDL+大豆卵磷脂+海藻糖冻存猪精子,对比研究解冻后猪精子的活率、顶体完整性、质膜完整性和获能样。结果表明:鸽蛋LDL、大豆卵磷脂和海藻糖同时添加组冻存精子效果显著优于三种添加物两两配伍组别（P<0.05）,其中添加LDL0.07g/mL +海藻糖0.05g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组猪精子冻融后活率最高,为47.87%。与LDL 0.08 g/mL +海藻糖0.04 g/mL +大豆卵磷脂0.05 g/mL组和LDL0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05 g/mL组冻后精子活率差异不明显（P<0.01）,同时由于添加物浓度的增加使得该组精子的获能样显著多于其他组别（P<0.05）。表明LDL 0.07g/mL+海藻糖0.05g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组、LDL0.08+海藻糖0.04+大豆卵磷脂0.05组和LDL0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组均可以提高精子冻后活率、质膜完整性和顶体完整性,提高精子抵抗低温胁迫能力。3、LDL、海藻糖和大豆卵磷脂可以有效的减少精子在平衡阶段和解冻阶段的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）损伤。当添加LDL 0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组时,SOD活性在解冻后高于其他各组,差异显著（P<0.05）。当添加LDL0.07g/mL+海藻糖0.05g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL时可以有效减少冷冻过程中CAT的损伤,但是与LDL0.08 g/mL +海藻糖0.04 g/mL +大豆卵磷脂0.05 g/mL组和LDL0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组差异不明显（P<0.05）。当添加LDL0.08g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL时可以有效减少冷冻过程中GSH-Px的损伤,但是与LDL0.07g/mL+海藻糖0.05g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL和LDL0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL组差异不明显（P<0.05）。本研究表明猪冷冻精液稀释液中添加LDL 0.09g/mL+海藻糖0.04g/mL+大豆卵磷脂0.05g/mL是最佳的冷冻稀释液配伍方式,可以有效的提高冻后精子活率、顶体完整性和质膜完整性,并在冷冻过程中保护SOD活性减少低温打击损伤。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪冷冻精液研究进展
• 引言
• 1.1 精液冷冻保存原理
• 1.2 精液冷冻保存研究进展
• 1.2.1 冷冻程序研究
• 1.2.2 冷冻精子的形态学变化
• 1.2.3 冷冻保护剂研究
• 1.3 本研究的目的与意义
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究意义
• 试验研究
• 第二章 五种禽类卵黄低密度脂蛋白（LDL）对猪精子冷冻效果的影响
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器设备与试剂
• 2.1.2 主要试剂配制
• 2.1.3 试验设计
• 2.1.4 LDL 的提取
• 2.1.5 精液采集
• 2.1.6 精液冷冻
• 2.1.7 冻精解冻
• 2.1.8 精子品质检测
• 2.1.9 数据统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同禽类、不同浓度卵黄LDL 对猪精子活率的影响
• 2.2.2 五种最佳添加浓度LDL 对猪精子冷冻效果的影响
• 2.2.3 精子活率与顶体完整率和质膜完整性的相关性分析
• 2.3 讨论
• 第三章 鸽蛋卵黄低密度脂蛋白、大豆卵磷脂和海藻糖的配伍效应
• 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 溶液配制
• 3.1.3 精液采集与预处理
• 3.1.4 精液冷冻一解冻
• 3.1.5 精液品质的检查
• 3.2 试验设计
• 3.3 数据统计分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 添加大豆卵磷脂和鸽蛋卵黄LDL 对冻后猪精子活率的影响
• 3.4.2 添加大豆卵磷脂和海藻糖对冻后猪精子活率的影响
• 3.4.3 添加海藻糖和鸽蛋卵黄LDL 对冻后猪精子活率的影响
• 3.4.4 添加鸽蛋卵黄LDL、大豆卵磷脂和海藻糖对冻后猪精子活率的影响
• 3.4.5 六组最优配方对猪精子冻后生物机能的影响
• 3.5 讨论
• 第四章 不同冷冻保护剂对猪精子冻后SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影响
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 溶液配制
• 4.1.3 精液采集与预处理
• 4.1.4 精液冷冻一解冻
• 4.1.5 精液品质的检查
• 4.1.6 冻后精子酶活性测定
• 4.2 试验设计
• 4.3 数据统计分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 精子SOD 活性
• 4.4.2 精子CAT 活性
• 4.4.3 精子GSH-Px 活性
• 4.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介