转鲑鱼降钙素基因酵母对骨质疏松和血管钙化作用的研究

论文摘要

降钙素（calcitonin,CT）是一种32个氨基酸组成的多肽类激素。临床应用鲑鱼降钙素（salmon calcitonin,sCT）治疗骨质疏松,而现有给药途径仅仅注射和鼻喷两种,且昂贵的价格也限制了它在我国的普及。实现鲑鱼降钙素的口服给药（转鲑鱼降钙素基因酵母yAGA2-sCT）将是最为理想的选择。为研究转鲑鱼降钙素基因酵母（yAGA2-sCT）对骨质疏松大鼠的作用,我们建立了骨质疏松大鼠模型,观察sCT和yAGA2-sCT对骨质疏松大鼠骨密度、骨形态计量学影响;同时检测血钙、血碱性磷酸酶、血清骨钙素、血清胰岛素样生长因子-1以及尿钙、羟脯氨酸等经典的骨代谢生化标志物水平以观察sCT和yAGA2-sCT对骨代谢的影响。实验分假手术组、模型对照组、sCT组及yAGA2-sCT组。通过大鼠股骨X光照片、光镜观察及骨密度值检测说明骨质疏松大鼠造模成功。sCT组及yAGA2-sCT组的腰椎和股骨骨密度及骨代谢生化标志物水平明显得到改善,提示sCT及yAGA2-sCT通过抑制骨吸收从而抑制了骨质疏松。sCT组及yAGA2-sCT组两组比较差异无显著性,提示口服yAGA2-sCT与sCT注射液对骨质疏松大鼠有相似的作用,均具有干预骨重建、抑制骨质疏松的作用。为进一步探讨转鲑鱼降钙素基因酵母（yAGA2-sCT）对骨质疏松的作用机制,我们观察了yAGA2-sCT对体外成骨细胞的作用。应用酶消化-连续组织块法体外培养大鼠成骨细胞,观察sCT和yAGA2-sCT对体外培养成骨细胞增殖、分化、矿化功能的影响。经病理学检查及染色证实体外培养成骨细胞成功;sCT及yAGA2-sCT对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化功能具有刺激作用。众所周知老年患者发生骨质疏松的同时常常伴发血管钙化。近来认为三个新发现的肿瘤坏死因子家族成员骨保护素（Osteoprotegrin,OPG）,核因子kB受体激活物配体（ Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL）和核因子kB受体激活物（Receptor activator of nuclear factor kappaB,RANK）,亦称OPG/RANKL/RANK系统,参与骨质疏松和血管钙化的调节过程,是这两种伴发疾病之间的分子联系。为研究OPG/RANKL/RANK系统在血管钙化中的调节作用以及降钙素对OPG/RANKL/RANK途径的干预作用,本实验建立了大鼠动脉钙化模型,病理学观察血管钙化情况,测定血管组织中钙含量及碱性磷酸酶活性,免疫组化法检测OPG和RANKL在血管组织中的表达。实验分对照组、模型组、sCT组及yAGA2-sCT组。病理学观察成功建立维生素D3诱发的血管钙化模型;与对照组比较,钙化血管组织中钙含量及碱性磷酸酶活性增高;模型组血管壁OPG表达明显减少而RANKL表达明显增加。与模型组比较,sCT组和yAGA2-sCT组血管钙化程度明显减轻,血管壁OPG表达明显增加而RANKL表达明显减少。提示OPG/RANKL/RANK系统参与血管钙化的调节,sCT和yAGA2-sCT可通过OPG/RANKL/RANK途径有效抑制血管钙化。为进一步观察RANKL对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）体外钙化的调节作用及降钙素对其调节作用的影响,我们体外培养大鼠VSMC,建立体外VSMC钙化模型,在培养介质中分别加入RANKL及降钙素,观察细胞钙沉积及细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素的变化情况。VSMC经von Kossa染色证实动脉钙化模型成功建立。实验分对照组、钙化模型组、RANKL组、sCT组及yAGA2-sCT组。钙化模型组、RANKL组、sCT组及sCT组钙沉积、碱性磷酸酶活性、骨钙素水平明显高于对照组;与钙化模型组比较,RANKL组钙沉积、碱性磷酸酶活性、骨钙素水平均明显增高;与RANKL组比较, sCT组和yAGA2-sCT组钙沉积、碱性磷酸酶活性、骨钙素水平明显降低。提示RANKL促进钙化培养的VSMC钙沉积、碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达,而sCT和yAGA2-sCT能够抑制RANKL的以上效应。此结果进一步提示RANKL可促进钙化培养的VSMC的钙质沉积,其作用可能与增加细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达、促进VSMC向成骨细胞转化有关,而sCT和yAGA2-sCT可通过对RANKL的抑制作用、通过OPG/RANKL/RANK途径抑制VSMC钙化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述和立项依据
• 第一节 骨质疏松
• 1 骨与骨代谢
• 2 骨质疏松的病因和病理机制
• 3 骨质疏松的诊断标准
• 4 骨质疏松的治疗
• 第二节 血管钙化
• 1 血管钙化概况
• 2 血管钙化的发病机制
• 3 血管钙化的防治
• 第三节 骨质疏松和血管钙化的相关性
• 1 流行病学调查
• 2 骨质疏松和血管钙化的共同病因
• 3 发病机理
• 4 临床药物治疗进展
• 第四节 降钙素的研究进展
• 1 降钙素的发现
• 2 降钙素的基因结构
• 3 降钙素的作用机理
• 4 降钙素的生物活性
• 5 降钙素与骨代谢的关系
• 6 降钙素治疗骨质疏松的作用机制
• 7 降钙素异源表达的发展趋势
• 第五节 立项依据、技术路线及本文的创新性
• 1 立项依据
• 2 技术路线
• 3 本实验室工作基础
• 4 本文的创新性
• 第二章 转鲑鱼降钙素基因酵母对骨质疏松大鼠的作用
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 转鲑鱼降钙素基因酵母对体外培养成骨细胞的作用
• 1 前言
• 2 材料及方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 转鲑鱼降钙素基因酵母对大鼠钙化血管中OPG/RANKL 表达的影响
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五章 转鲑鱼降钙素基因酵母对大鼠血管平滑肌细胞体外钙化的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文章发表状况
• 附录
• 致谢