异三聚体G蛋白在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用

论文摘要

本文以拟南芥Col悬浮细胞系、Col为遗传背景条件下的GPwA1过表达细胞系、AGB1过表达细胞系以及AGB1突变体agb1-2悬浮培养细胞系为材料,结合外源2,4-D/NAA处理,探讨了G蛋白在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用,取得了以下主要实验结果。1.使用不同浓度的2,4-D/NAA处理拟南芥Col悬浮细胞的结果表明,2μM 2,4-D对拟南芥的细胞分裂过程有显著的促进作用,悬浮细胞中GPA1和AGB1的表达量增加,细胞的长宽比显著小于无外源生长素处理。2μM的NAA对拟南芥悬浮细胞的分裂促进作用较弱,但显著促进细胞的伸长生长,NAA诱导条件下GPA1的表达量未见有显著变化,但AGB1的表达量显著增加。2.用RT-PCR和TOPO克隆的方法从野生型拟南芥（Col）中克隆了GPA1和AGB1基因,将克隆的基因序列与35S-启动子和报告基因（GFP）相融合构建了过表达载体,通过农杆菌介导的方法获得了GPA1和AGB1基因过表达的拟南芥转基因悬浮细胞系。荧光定位结果表明,GPA1和AGB1主要定位于质膜部分,原生质体瞬时表达定位结果与细胞水平定位结果一致。3.无外源生长素处理条件下,过表达AGB1细胞系的细胞分裂指数显著低于Col。AGB1突变体细胞系和过表达GPA1细胞系的细胞分裂指数显著高于Col,细胞分裂周期素基因AtCYCD4;1的表达量相对较高,但是AGB1突变体细胞系和过表达GPA1细胞系对2,4-D诱导的细胞分裂过程不敏感。4.无外源生长素处理条件下,过表达AGB1的细胞长度显著长于Col,而AGB1突变体细胞系多为圆形,其细胞长径显著小于Col。外源NAA处理显著促进了突变体agb1-2细胞和GPA1过表达悬浮细胞对NAA诱导的细胞伸长的响应。RT-PCR结果表明,agb1-2和GPA1过表达悬浮细胞中与细胞伸长相关的ABP1的表达量显著增加。根据上述研究结果,可以达到以下初步结论:（1）GPA1对2,4-D所诱导的细胞分裂过程具有促进作用;（2）AGB1对细胞分裂过程具有负调节作用;对NAA所诱导的细胞伸长过程具有促进作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文对照词
• 第一章 文献综述
• 1 异三聚体G 蛋白与植物的生长发育
• 1.1 G 蛋白
• 1.1.1 G 蛋白各组成的基因
• 1.1.2 G 蛋白的结构
• 1.1.3 植物G 蛋白的生物学定位
• 1.1.4 G 蛋白信号转导系统
• 1.1.4.1 G 蛋白的作用模式
• 1.1.4.2 G 蛋白参与的植物细胞信号转导途径
• 1.1.4.2.1 G 蛋白在光信号转导途径中的作用
• 1.1.4.2.2 G 蛋白在抗真菌防御机制中的作用
• 1.1.4.2.3 G 蛋白在脱落酸信号转导途径中的作用
• 1.1.4.2.4 G 蛋白在调控细胞分裂周期进程中的作用
• 1.1.4.2.5 G 蛋白在生长素（Auxin）信号转导中的作用
• 1.2 G 蛋白在植物的生长发育过程中的作用
• 1.2.1 Gα在植物发育中的作用
• 1.2.2 Gβ在植物生长发育中的作用
• 1.2.3 Gγ在植物生长发育中的作用
• 2. 生长素与细胞的分裂和伸长
• 2.1 生长素与生长素的极性运输
• 2.2 生长素与植物细胞的分裂和伸长调节
• 2.2.1 生长素与植物细胞分裂的调节
• 2.2.2 生长素与植物细胞伸长的调节
• 3. 本研究的目的及研究内容
• 第二章 2,4-D 和 NAA 在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 悬浮培养细胞系的建立
• 2.2.2 悬浮细胞研究方法
• 2.2.2.1 细胞处理
• 2.2.2.2 生物量鲜重的称量
• 2.2.2.3 显微观察
• 2.2.2.4 细胞分裂指数的荧光观察
• 2.2.3 AGB1 和GPA1 基因的 RT-PCR
• 2.2.3.1 引物的设计
• 2.2.3.2 总RNA 提取
• 2.2.3.3 第一链cDNA 的合成
• 2.2.3.4 PCR 扩增
• 2.2.4 悬浮细胞的 Western-blot 分析
• 2.2.4.1 膜蛋白的提取
• 2.2.4.2 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE
• 2.2.4.3 Western Blotting
• 3. 结果与分析
• 3.1 拟南芥悬浮培养细胞系的建立
• 3.2 2,4-D 和 NAA 在拟南芥Col 悬浮细胞中的作用
• 3.2.1 2,4-D 和NAA 对拟南芥悬浮细胞生长发育的影响
• 3.2.2 2,4-D 和NAA 对Col 悬浮细胞分裂的影响
• 3.2.3 2,4-D 和NAA 对Col 悬浮细胞伸长的影响
• 3.3 2,4-D 和 NAA 处理Col 细胞中 GPA1 和AGB1 相对表达量的变化
• 3.4 2,4-D 和 NAA 处理 Col 细胞中GPA1 蛋白水平的表达量变化
• 4. 讨论
• 4.1 适宜浓度的2,4-D 和NAA 在细胞分裂和细胞伸长中的作用不同
• 4.2 适宜浓度的2,4-D 和NAA 可有效区分拟南芥细胞对细胞分裂和细胞伸长的不同响应
• 4.3 G蛋白不同亚基在2,4-D和NAA诱导的细胞分裂和细胞伸长中可能具有不同的作用
• 第三章 G 蛋白在拟南芥悬浮细胞分裂和伸长中的作用
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 GPA1 和AGB1 过表达悬浮细胞系的构建
• 2.1.1 拟南芥 GPA1、AGB1 基因的克隆与转化
• 2.1.1.1 引物的设计
• 2.1.1.2 总 RNA 提取
• 2.1.1.3 第一链cDNA 的合成
• 2.1.1.4 PCR 扩增GPA1 和AGB1 基因全长cDNA 序列
• 2.1.1.5 PCR 产物的 TOPO 克隆及其序列分析
• 2.1.1.6 农杆菌的转化培养
• 2.1.2 农杆菌介导的细胞转化
• 2.2 转化细胞的GFP-PCR 鉴定
• 2.3 AGB1 功能缺失突变体agb1-2 悬浮细胞系建立
• 2.4 悬浮细胞的形态学观察
• 2.5 悬浮细胞的细胞分裂指数的确定
• 2.6 悬浮细胞中相关基因的半定量RT-PCR
• 2.7 原生质体制备与转化
• 2.8 过表达细胞系及原生质体的荧光观察
• 3. 结果与分析
• 3.1 agb1-2 悬浮细胞系鉴定
• 3.2 转基因细胞系的构建
• 3.2.1 GPA1 基因和AGB1 基因的全长cDNA 序列的获得
• 3.2.2 GPA1 和 AGB1 基因的TOPO 克隆与鉴定
• 3.2.3 LR 连接反应及产物鉴定
• 3.2.4 过表达的转基因细胞系的转化及鉴定
• 3.3 过表达悬浮细胞系中G 蛋白的亚细胞定位
• 3.3.1 细胞水平G 蛋白定位
• 3.3.2 原生质水平G 蛋白的定位
• 3.4 突变体、野生型、过表达悬浮细胞的形态特征
• 3.5 不同基因型细胞对2,4-D 和NAA 处理的响应分析
• 3.5.1 2,4-D/NAA 处理对细胞形态变化的影响
• 3.5.2 2,4-D/NAA 处理对细胞分裂指数变化的影响
• 3.6 2,4-D/NAA 处理对不同基因型细胞中 ABP1 相对表达量的影响
• 3.7 2,4-D/NAA 处理对不同基因型细胞中 AtCYCD4;1 相对表达量的影响
• 4. 讨论
• 4.1 GPA1对细胞分裂过程具有促进作用
• 4.2 AGB1对细胞分裂过程具有负调节作用，对细胞伸长过程具有正调节作用
• 第四章 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢