论文摘要
本论文选取了非人灵长类动物——食蟹猴为研究对象,采用组织块贴壁培养法,构建了食蟹猴耳部组织成纤维细胞的体外培养体系,并对其生长特性进行了研究。在建立培养体系的基础上,运用MTT比色法分析了不同浓度表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对5%和10%两种血清浓度下培养细胞增殖能力的影响。研究结果如下:1、采用组织块培养法可以获得食蟹猴耳部原代培养物。2、用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代。3～5次传代后,培养细胞逐渐纯化,为典型的成纤维型细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形。细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走势。3、用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液,采取手工冷冻法对细胞进行冷冻保存,冻存浓度为5×106个/ml。通过台盼蓝染色法对不同代数细胞冻存前后活率进行测定,结果发现虽然复苏后存活率有所下降,但均保持在90%以上,传代后细胞形态和生长速度没有明显变化。4、绘制的细胞生长曲线呈“S”型,细胞生长经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合体外细胞生长规律。5、对第10、15、20和25代细胞的染色体倍性进行分析,发现二倍体染色体数为2n=42。虽然随着传代次数的增加,二倍体细胞所占比例有所下降,但仍在80%以上,且四代之间无显著差异（P＞0.05）。6、当培养液中血清浓度为5%时,分别添加20～80 ng/ml的EGF、1、5μg/ml的胰岛素、50～100 ng/ml浓度的IGF-I可显著促进细胞增殖（P＜0.05）。7、当培养液中血清浓度为10%时,分别添加10～40 ng/ml的EGF、10、15μg/ml的胰岛素、25～100 ng/ml浓度范围内的IGF-I可显著促进细胞增殖（P＜0.05）。
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摘要ABSTRACT第一部分 文献综述前言1 动物细胞体外培养简史2 动物细胞体外培养的主要环节2.1 原代细胞的获得及培养2.1.1 酶消化法2.1.2 组织块培养法2.2 传代培养2.3 细胞的冻存和复苏3 细胞在体外的生长过程3.1 细胞体外培养的整个生长过程3.2 细胞在体外培养一代内的生长过程4 影响动物细胞体外生长的因素4.1 培养基对细胞生长的影响4.1.1 合成培养基4.1.2 天然培养基4.1.3 促细胞生长物质4.2 物理化学因素的影响4.2.1 pH及气相4.2.2 温度4.2.3 渗透压4.3 微生物污染4.4 其他因素5 本试验研究的目的和意义第二部分 试验研究第一章 食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养体系的初步建立第一节 前言第二节 材料和方法2.1 材料2.1.1 试验材料2.1.2 主要试剂及药品2.1.3 主要仪器设备及耗材2.1.4 主要溶液配制2.2 试验方法2.2.1 食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞的分离和体外培养2.2.2 细胞活力检测2.2.3 细胞生长曲线的绘制2.2.4 细胞染色体制备2.3 数据统计方法第三节 结果与分析3.1 食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养的形态学观察3.1.1 原代细胞的生长情况3.1.2 细胞的传代培养3.2 细胞的冻存与复苏3.3 细胞生长曲线绘制3.4 细胞染色体倍性分析第四节 讨论4.1 食蟹猴耳部成纤维细胞的分离和原代培养4.2 成纤维细胞的传代培养4.3 细胞生长曲线的绘制4.4 细胞的冻存与复苏4.5 染色体倍性分析第五节 小结第二章 EGF、Insulin和IGF-I对体外培养的食蟹猴耳部成纤维细胞增殖的影响第一节 前言第二节 材料和方法2.1 试验材料2.1.1 试验动物2.1.2 主要试剂及药品2.1.3 主要仪器2.1.4 主要溶液配制2.2 试验方法2.2.1 耳部成纤维细胞的培养2.2.2 用MTT比色法检测添加不同物质对食蟹猴耳部成纤维细胞增殖的影响2.2.3 试验设计2.3 数据统计方法第三节 结果与分析3.1 不同浓度EGF对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响3.2 不同浓度胰岛素对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响3.3 不同浓度IGF-I对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖的影响第四节 讨论4.1 MTT比色法在检测细胞增殖的应用及其影响因素4.2 EGF对细胞增殖的影响4.3 胰岛素对细胞增殖的影响4.4 IGF-I对细胞增殖的影响第五节 小结第三部分 总结和结论1、总结2、结论参考文献附录附图致谢攻读学位期间发表论文情况
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