本文主要研究内容
作者常振策（2019）在《家蝇Clip-Msp和Mdctl基因克隆表达及白假丝酵母菌刺激下Clip-Msp时空表达模式的研究》一文中研究指出：目的:克隆表达家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因(Clip-serine protease gene of Musca domestica,Clip-Msp)和C型凝集素基因(C-type lectin gene of Musca domestica,Mdctl),并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:从课题组前期构建的微生物感染后免疫相关基因文库中筛选得到高表达基因Clip-Msp(GeneID:LOC101901626)和Mdctl(GeneID:LOC101890789),然后依据NCBI网站上的预测序列设计引物,以家蝇三龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增目的片段。使用生物信息学软件对它们的序列及编码蛋白作分析和预测。通过基因工程的方法,构建pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl重组质粒,随后导入到大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达。表达产物和Ni-IDA Agarose纯化蛋白用SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。以GAPDH作为内参,运用实时荧光定量PCR方法检测Clip-Msp在家蝇三龄幼虫感染白假丝酵母菌后3h、12h、24h以及48h不同组织(体壁、脂肪体、血淋巴、唾液腺、肠道、马氏管和气管)中的表达情况。结果:家蝇Clip-Msp基因开放阅读框(ORF)长度为1524 bp,编码蛋白长度507个氨基酸,其理论分子量约为56320.1 Da,等电点约为8.52。蛋白质在溶液中性质不稳定;总体疏水性较高,无信号肽,属于非经典分泌型蛋白。Clip-Msp蛋白的N端存在一个Clip结构域,C端有一个Tryp_SPc催化结构域,属于单催化结构域Clip-丝氨酸蛋白酶超家族。Mdctl基因ORF长度为333 bp,其蛋白包含110个氨基酸残基,分子量为13131.42 Da,等电点为4.49,信号肽范围为1-22位氨基酸,是分泌型蛋白。Mdctl蛋白中存在Clect结构域,属于C型凝集素超家族。成功构建pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl表达质粒,经IPTG诱导后两种重组蛋白均在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,其分子量与理论值相一致。实时荧光定量PCR结果显示:白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后,Clip-Msp基因在所有检测组织中表达均上调,不同时间点、不同组织中表达有极显著差异(P<0.05)。3h时以血淋巴中表达量增加最高;12h时以脂肪体、气管、唾液腺和肠道中表达量增加为主,其中脂肪体内的相对表达量最高;24h时主要在肠道中表达增加最明显,脂肪体次之;48h时血淋巴中表达量高于其它所有组织。结果分析得出:Clip-Msp基因主要分布在血淋巴、脂肪体和肠道中。结论:家蝇Clip-Msp由507个氨基酸组成,无信号肽,为Clip-SP家族新成员。家蝇三龄幼虫在白假丝酵母菌感染后,虫体组织中Clip-Msp基因的表达随时间的推移呈现先升高后降低的趋势,其中以血淋巴、脂肪体和肠道的表达量增加最为明显。Mdctl基因编码家蝇新凝集素,属于C型凝集素超家族。本研究成功建立pET-28a/Clip-Msp和pET-28a/Mdctl原核表达体系,获得了它们的重组蛋白。结果提示Clip-Msp和Mdctl可能参与了家蝇真菌感染的免疫反应,也为进一步对家蝇Clip-Msp和Mdctl的研究提供了基础。
Abstract
mu de :ke long biao da jia ying de Clip-si an suan dan bai mei ji yin (Clip-serine protease gene of Musca domestica,Clip-Msp)he Cxing ning ji su ji yin (C-type lectin gene of Musca domestica,Mdctl),bing dui Clip-Mspzai bai jia si jiao mu jun gan ran hou de shi kong biao da mo shi jin hang yan jiu 。fang fa :cong ke ti zu qian ji gou jian de wei sheng wu gan ran hou mian yi xiang guan ji yin wen ku zhong shai shua de dao gao biao da ji yin Clip-Msp(GeneID:LOC101901626)he Mdctl(GeneID:LOC101890789),ran hou yi ju NCBIwang zhan shang de yu ce xu lie she ji yin wu ,yi jia ying san ling you chong cDNAwei mo ban ,PCRkuo zeng mu de pian duan 。shi yong sheng wu xin xi xue ruan jian dui ta men de xu lie ji bian ma dan bai zuo fen xi he yu ce 。tong guo ji yin gong cheng de fang fa ,gou jian pET-28a/Clip-Msphe pET-28a/Mdctlchong zu zhi li ,sui hou dao ru dao da chang gan jun BL21-DE3zhong you dao biao da 。biao da chan wu he Ni-IDA Agarosechun hua dan bai yong SDS-PAGEhe Western-Blotfen xi jian ding 。yi GAPDHzuo wei nei can ,yun yong shi shi ying guang ding liang PCRfang fa jian ce Clip-Mspzai jia ying san ling you chong gan ran bai jia si jiao mu jun hou 3h、12h、24hyi ji 48hbu tong zu zhi (ti bi 、zhi fang ti 、xie lin ba 、tuo ye xian 、chang dao 、ma shi guan he qi guan )zhong de biao da qing kuang 。jie guo :jia ying Clip-Mspji yin kai fang yue dou kuang (ORF)chang du wei 1524 bp,bian ma dan bai chang du 507ge an ji suan ,ji li lun fen zi liang yao wei 56320.1 Da,deng dian dian yao wei 8.52。dan bai zhi zai rong ye zhong xing zhi bu wen ding ;zong ti shu shui xing jiao gao ,mo xin hao tai ,shu yu fei jing dian fen bi xing dan bai 。Clip-Mspdan bai de Nduan cun zai yi ge Clipjie gou yu ,Cduan you yi ge Tryp_SPccui hua jie gou yu ,shu yu chan cui hua jie gou yu Clip-si an suan dan bai mei chao jia zu 。Mdctlji yin ORFchang du wei 333 bp,ji dan bai bao han 110ge an ji suan can ji ,fen zi liang wei 13131.42 Da,deng dian dian wei 4.49,xin hao tai fan wei wei 1-22wei an ji suan ,shi fen bi xing dan bai 。Mdctldan bai zhong cun zai Clectjie gou yu ,shu yu Cxing ning ji su chao jia zu 。cheng gong gou jian pET-28a/Clip-Msphe pET-28a/Mdctlbiao da zhi li ,jing IPTGyou dao hou liang chong chong zu dan bai jun zai da chang gan jun zhong zhu yao yi bao han ti de xing shi biao da ,ji fen zi liang yu li lun zhi xiang yi zhi 。shi shi ying guang ding liang PCRjie guo xian shi :bai jia si jiao mu jun gan ran jia ying san ling you chong hou ,Clip-Mspji yin zai suo you jian ce zu zhi zhong biao da jun shang diao ,bu tong shi jian dian 、bu tong zu zhi zhong biao da you ji xian zhe cha yi (P<0.05)。3hshi yi xie lin ba zhong biao da liang zeng jia zui gao ;12hshi yi zhi fang ti 、qi guan 、tuo ye xian he chang dao zhong biao da liang zeng jia wei zhu ,ji zhong zhi fang ti nei de xiang dui biao da liang zui gao ;24hshi zhu yao zai chang dao zhong biao da zeng jia zui ming xian ,zhi fang ti ci zhi ;48hshi xie lin ba zhong biao da liang gao yu ji ta suo you zu zhi 。jie guo fen xi de chu :Clip-Mspji yin zhu yao fen bu zai xie lin ba 、zhi fang ti he chang dao zhong 。jie lun :jia ying Clip-Mspyou 507ge an ji suan zu cheng ,mo xin hao tai ,wei Clip-SPjia zu xin cheng yuan 。jia ying san ling you chong zai bai jia si jiao mu jun gan ran hou ,chong ti zu zhi zhong Clip-Mspji yin de biao da sui shi jian de tui yi cheng xian xian sheng gao hou jiang di de qu shi ,ji zhong yi xie lin ba 、zhi fang ti he chang dao de biao da liang zeng jia zui wei ming xian 。Mdctlji yin bian ma jia ying xin ning ji su ,shu yu Cxing ning ji su chao jia zu 。ben yan jiu cheng gong jian li pET-28a/Clip-Msphe pET-28a/Mdctlyuan he biao da ti ji ,huo de le ta men de chong zu dan bai 。jie guo di shi Clip-Msphe Mdctlke neng can yu le jia ying zhen jun gan ran de mian yi fan ying ,ye wei jin yi bu dui jia ying Clip-Msphe Mdctlde yan jiu di gong le ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自贵州医科大学的常振策，发表于刊物贵州医科大学2019-07-01论文，是一篇关于家蝇论文,原核表达论文,时空表达论文,白假丝酵母菌论文,贵州医科大学2019-07-01论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自贵州医科大学2019-07-01论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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