论文摘要
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统由于其高表达、高稳定和高分泌特性，越来越广泛地被应用于多种外源蛋白表达及目的蛋白功能的研究。但外源蛋白在分泌表达过程中，易受酵母内源性蛋白酶的作用而发生降解，导致目的蛋白表达量降低。同时，利用其表达一些人源性蛋白分子和细胞因子时，产物糖基化水平仍偏高。PMR1（Plasma membrane ATPase related 1）广泛存在于各真核生物体中，编码一种新P型钙／锰离子泵，定位于高尔基体膜上。它是调节细胞内钙离子浓度的重要蛋白质之一，同时也直接影响细胞生长及蛋白分泌。研究显示，一些物种的PMR1无义突变株可显著提高外源蛋白表达量，同时也可明显降低其外链糖基化水平。本研究通过构建PMR1无义突变株来提高外源蛋白的表达量，同时降低其外链糖基化水平。首先通过CODEHOP PCR和反向PCR技术分离克隆得到毕赤酵母PMR1，然后构建打靶质粒转化毕赤酵母GS115野生菌株，经基因同源重组得到PMR1无义突变菌株，再利用报告蛋白HSA、HSA-IFN-α-2b、HSA-GHRH和GA分别进行诱导表达，对无义突变株进行评价。结果显示，PMR1无义突变株缺陷菌株生长受EGTA显著抑制，但可通过添加外源钙离子得到缓解。同时，与野生菌株相比，对于糖基化位点少的外源蛋白，毕赤酵母PMR1无义突变菌株外源蛋白表达量明显降低，但在培养基中添加钙离子后产量明显提高。糖基化程度高的蛋白GA在工程菌中表达可明显提高产量，添加钙离子后则恢复至野生菌株表达水平。在考察低溶氧条件下外源蛋白表达过程中发现，GS115野生菌株外源蛋白表达量随溶氧下降而明显降低，而工程菌中外源蛋白表达量无显著变化，故有望将工程菌应用于工业化发酵培养，以期解决野生菌株处于缺氧状态下外源蛋白表达无法达到最佳状态问题。
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摘要ABSTRACT第一章 前言1.1 酵母表达系统概况1.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优越性1.3 毕赤酵母表达系统存在的问题1.4 PMR1及其编码蛋白概况1.5 病理学研究1.6 展望1.7 研究目标第二章 实验材料2.1 材料2.1.1 菌株2.1.2 质粒2.1.3 蛋白标准品2.1.4 限制性内切酶及工具酶2.1.5 试剂盒2.1.6 核酸及蛋白分子量标准2.1.7 主要仪器2.2 试剂2.2.1 主要试剂2.2.2 主要培养基2.2.3 主要溶液2.2.4 特异性核苷酸引物设计第三章 实验方法3.1 Pichia pastoris PMR1全序列的确定3.1.1 CODEHOP PCR扩增PMR1编码序列部分片段3.1.2 反向PCR确定PMR1启动子及终止子序列3.1.3 PpPMR1全序列的克隆3.2 毕赤酵母PMR1无义突变株的构建3.2.1 打靶重组质粒pPMR1△的构建3.2.2 打靶载体pPMR1△转化巴斯德毕赤酵母菌GS1153.3 毕赤酵母PMR1无义突变菌株的表达评价3.3.1 PMR1缺失前后对外源蛋白表达量的影响3.3.2 PMR1缺失前后对外源蛋白糖基化水平的影响3.3.3 发酵液体积对外源蛋白表达量的影响3.3.4 发酵液中钙离子浓度对外源蛋白表达量的影响第四章 实验结果4.1 Pichia pastoris PMR1全序列的确定4.1.1 CODEHOP PCR扩增PpPMR1编码序列部分片段4.1.2 反向PCR确定PMR1启动子及终止子序列4.1.3 PpPMR1全序列的确定4.2 毕赤酵母PMR1无义突变株的构建4.2.1 打靶重组质粒的构建4.2.2 毕赤酵母PMR1无义突变株的构建4.2.3 毕赤酵母GS115 PMR1无义突变菌株的表型特征4.2.4 毕赤酵母GS115菌PMR1缺失前后生长曲线的比较4.3 PMR1无义突变菌株的表达评价4.3.1 PMR1缺失前后对外源蛋白表达量的影响4.3.2 PMR1缺失前后对外源蛋白糖基化水平的影响4.3.3 发酵液中钙离子浓度对外源蛋白表达量的影响4.3.4 发酵液体积对外源蛋白表达量的影响第五章 讨论5.1 CODEHOP PCR克隆未知基因反向PCR克隆新基因5.2 反向PCR克隆已知基因侧翼DNA序列5.3 PMR1序列的分析5.4 PMR1同源重组失活方法的探讨5.5 毕赤酵母重组质粒同源臂长度对重组效率的影响5.6 巴斯德毕赤酵母菌的转化方法5.7 PMR1敲除前后外源蛋白表达情况结论参考文献致谢作者简介学位论文期间发表文章
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- [1].沉默PMR1表达促进胰岛细胞分泌胰岛素的研究[J]. 南方医科大学学报 2009(08)
标签：巴斯德毕赤酵母表达系统论文; 基因同源重组论文; 钙离子论文;
