食品中庆大霉素兽药残留酶联免疫检测方法研究

论文摘要

本论文对动物食品中庆大霉素残留的酶联免疫检测方法进行了系统研究。采用碳化二亚胺法将庆大霉素与钥孔嘁血蓝蛋白连接制得免疫原免疫兔子,免疫亲和柱纯化血清得到高效价和高特异性的庆大霉素多克隆抗体。采用碳二亚胺法与辣根过氧化物酶连接制得酶标抗原,建立了一种省时且高灵敏度的直接竞争ELISA检测方法,对影响实验的各因素(包被量,离子强度,pH值等)进行了优化与研究,包被量为0.5μg/孔,离子强度为0.01mol/L的PBS,pH为8.5时所获得的标准曲线灵敏度最高,稳定性最好。本实验所建立方法的灵敏度(IC50)为0.3gg/L,最低检出限(IC15)为0.03μg/L。对西索米星的交叉反应率为52.5%,对其他几种结构类似的氨基糖苷类抗生素交叉反应率较低。对牛奶、牛肉、猪肉、猪肝、猪肾、鸡肉、鱼肉、鸡蛋中的庆大霉素残留进行检测。牛奶基质：离心,弃去脂肪,7.5%的三氯乙酸提取离心后稀释100倍。组织基质：组织切碎样品用7.5%的三氯乙酸2倍提取离心后稀释50倍。鸡蛋基质：蛋清和蛋黄充分搅匀,用7.5%的三氯乙酸5倍提取离心后稀释20倍。不需要任何有机溶剂和前处理,添加三个不同浓度的庆大霉素兽药,回收率可达到69%～118%。本实验所建立方法在牛奶中检出限为3μg/L,在其它样品中检出限为3μg/kg。板内变异和板间变异均小于20%。以上证明本实验所建立的方法具有很高的准确性和精密度,满足快速检测的要求。通过37℃加速实验对抗体和酶标抗原的稳定性进行了研究,37℃存放3天后进行ELISA实验,标准曲线没有发生明显变化。通过与国外试剂盒的对比,本实验所建立的方法具有更高的灵敏度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 抗生素残留现状
• 1.2 快速检测分析技术发展趋势
• 1.2.1 农药残留快速检测分析技术
• 1.2.2 兽药残留快速检测分析技术
• 1.2.3 微生物快速检测分析技术
• 1.2.4 生物毒素快速检测分析技术
• 1.2.5 重金属快速检测分析技术
• 1.3 酶联免疫检测方法的建立
• 1.3.1 免疫原、包被原的制备
• 1.3.2 抗体的制备
• 1.3.3 抗原、抗体的标记
• 1.4 氨基糖苷抗生素
• 1.5 庆大霉素简介
• 1.5.1 化性质
• 1.5.2 体内代谢及毒性
• 1.5.3 作用机理
• 1.5.4 应用
• 1.5.5 最大残留限量
• 1.5.6 动物性食品中氨基糖苷类抗生素残留的检测方法
• 1.6 本课题的研究意义
• 1.7 本课题的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 待测样品
• 2.1.4 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半抗原和蛋白偶联
• 2.2.2 抗体的制备
• 2.2.3 直接竞争ELISA方法的建立
• 2.2.4 交叉反应率的测定
• 2.2.5 样品基质影响考察
• 2.2.6 庆大霉素直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.2.7 与国外试剂盒的比较
• 2.2.8 稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 半抗原与蛋白偶联
• 3.2 抗体的制备
• 3.2.1 血清效价测定
• 3.2.2 抗体的纯化
• 3.2.3 抗体的浓度
• 3.3 直接竞争ELISA方法的建立
• 3.3.1 直接竞争ELISA方法实验条件优化
• 3.3.2 直接竞争ELISA方法标准曲线建立
• 3.4 抗体特异性
• 3.5 基质影响研究
• 3.6 庆大霉素直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.6.1 检出限
• 3.6.2 方法准确度
• 3.6.3 精密度
• 3.6.4 与国外试剂盒的比较
• 3.7 稳定性实验
• 3.7.1 抗体的稳定性
• 3.7.2 酶标的稳定性
• 3.7.3 冻干抗体的稳定性
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢