论文摘要
第一部分肠道病毒EV71衣壳蛋白VP1基因的优化目的:为了使肠道病毒EV71的主要中和抗原VP1基因能够在哺乳动物细胞内有效表达,按照哺乳动物细胞密码子使用的偏好,对VP1基因序列进行密码子优化（codon optimization, opt）,并合成优化的VP1基因。方法:选取EV71 BJ4211株VP1基因（Genbank序列号EU024958.1）序列,用基因分析软件MacVector 7.2分析其基因编码序列,找出野生型VP1基因密码子使用的偏好性,并比较野生型EV71/BJ VP1的基因序列中与哺乳动物细胞密码子使用偏好不同的位点。对于与哺乳动物细胞使用偏好相同的密码子,用哺乳动物偏好的密码子替代野生型EV71/BJ VP1基因中使用偏好不同的密码子位点,然后设计出密码子优化的VP1基因。序列的优化还包括对基因mRNA的调整以使其更稳定和更易于在真核细胞中进行转录和翻译。密码子优化的VP1基因由德国Geneart公司合成,为便于目的基因的鉴定和插入,在基因两端分别加上限制性内切酶位点PstⅠ和BamHⅠ,装入骨架质粒pGA4,构建重组质粒pGA4/VP1-opt。将pGA4/VP1-opt转化大肠杆菌HB101,挑取单克隆,小量提取质粒鉴定;阳性克隆三次划氨苄青霉素（Amp）LB平板,获得含有pGA4/VP1-opt质粒的HB101菌种,20%甘油,-70℃保存。结果与结论:经酶切证实插入到载体pGA4中的基因片段大小正确,获得密码子优化的VP1基因。通过软件分析发现,与野生型VP1基因相比,密码子优化的VP1基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加,从而使其更适于在哺乳动物细胞中进行蛋白表达,但是其编码VP1蛋白的氨基酸序列不变,以保证原有的抗原构象。目的:为了提高EV71衣壳蛋白VP1基因在真核细胞的的表达和分泌水平,增强其免疫原性,以DNA疫苗为工具,通过选择合适的载体,改造基因表达和分泌的调控元件,设计并构建多种形式的密码子优化的VP1 DNA疫苗。通过分析不同形式的VP1 DNA疫苗在真核细胞的表达和分泌水平,及其免疫动物刺激产生抗体的能力,比较、评价何种形式的VP1蛋白表达和分泌最佳,具有良好的免疫原性,为筛选有效的EV71VP1蛋白候选疫苗奠定基础。方法:将pGA4/VP1-opt质粒用PstⅠ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切,通过割胶纯化获得密码子优化的VP1基因,插入到真核表达载体pJW4303中,构建基因优化的VP1 DNA疫苗pJW4303/VP1,由于本研究后续的设计均是基于此优化的VP1基因,因此这种单纯的基因优化的VP1 DNA疫苗称之为“野生型（widetype,即VP1-wt）”。通过设计PCR引物P1和P2,以pGA4/VP1-opt质粒为模板,扩增获得含有NheⅠ和BamHⅠ酶切位点的VP1基因,克隆到pJW4303载体的tPA信号肽序列下游,构建含有tPA信号肽的VP1 DNA疫苗pJW4303/tPA-VP1（tPA-VP1）,以促进蛋白的表达与分泌。为模拟自然状态下VP1易于自联形成二聚体的特点,设计双聚体VP1 DNA疫苗:合成PCR引物P3和P4,用P1和P4引物PCR扩增获得VP1插入片段1（Insert1,含NheⅠ和KpnⅠ酶切位点）,用P3和P2引物PCR扩增获得VP1插入片段2（Insert2,含KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点）,将Insert1和Insert2同时克隆到pJW4303载体的tPA信号肽序列下游,构建含有tPA信号肽的双聚体VP1 DNA疫苗pJW4303/tPA-VP1-dimer（dimer）。由于免疫球蛋白IgG Fc（Fcγ）片段在机体免疫中的巨大优势,分别设计引物,PCR扩增含有KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点的人Fcγ（huFcγ）和小鼠Fcγ（mFcγ）基因,将VP1-dimer质粒中的Insert2切掉,插入Fcγ基因,构建含Fcγ基因的VP1 DNA疫苗pJW4303/tPA-VP1-Fcγ（VP1- Fcγ）,达到增强抗原与免疫细胞的接触,提高免疫原性的目的。构建的重组质粒转化大肠杆菌HB101,挑取单克隆,进行质粒提取、酶切和测序鉴定。鉴定正确的阳性克隆三次划平板,进行甘油菌种保存。鉴定成功的重组质粒进行质粒大量提取,转染293T细胞,收获转染上清和细胞裂解产物,通过酶联免疫标记法（ELISA）、间接免疫荧光分析（IFA）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测转染细胞中VP1蛋白的表达。提取的质粒还用于免疫动物,免疫方法采用肌肉注射加电转录活体基因导入方式,免疫剂量为200μg/兔。免疫在0、2、4和第8周进行,共4次。每次免疫前采血,分离血清,通过检测血清中特异性IgG抗体的应答水平,比较不同形式VP1 DNA疫苗的刺激产生抗体的能力,综合评价疫苗的免疫原性。结果和结论:基于密码子优化的VP1基因,成功设计和构建了五种形式的VP1 DNA疫苗:VP1-wt、tPA-VP1、VP1-dimer、VP1- huFcγ和VP1- mFcγ。五种形式的VP1 DNA疫苗均能在真核293T细胞中表达,加tPA信号肽后,VP1蛋白表达和细胞外分泌水平均明显增加;VP1-dimer的表达和分泌水平则进一步提高。VP1-huFc重组质粒不仅表达水平显著增加,其在Fc的引导下,细胞外分泌水平也大大提高。而加有mFcγ片段的VP1 DNA疫苗的表达和分泌则并不理想。五种DNA疫苗免疫新西兰白兔发现,tPA-VP1免疫原性也较好,产生抗体水平最高。
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