菲并吲哚里西啶类生物碱13a-(S)-去氧娃儿藤宁的抗肿瘤作用及机制研究

菲并吲哚里西啶类生物碱13a-(S)-去氧娃儿藤宁的抗肿瘤作用及机制研究

论文摘要

菲并吲哚里西啶类生物碱是一类植物来源的小分子化合物,具有多种药理学活性。其结构母核完全不同于已上市的任何一种抗肿瘤药物。这类生物碱的生物学作用广泛,包括抗肿瘤作用、抗炎作用、抗阿米巴虫作用和抗病毒作用等。菲并吲哚里西啶类生物碱抗肿瘤作用瘤谱和其特异性的分子靶标尚不清楚。为此,本文对其抗肿瘤作用及其作用机制进行了较详尽地研究。右旋去氧娃儿藤宁((+)-13 a-(S)-Deoxytylophorinine,简称CAT)是最早从萝藦科(Asclepiadaceae)娃儿藤属(Tylophora)的植物三分丹(Tylophora atrofolliculata)和卵叶娃儿藤(Tylophora ovata)中提取出的菲并吲哚里西啶类化合物,因其植物中含量很低,来源有限,因此,对该化合物进行了化学全合成。我们首先检测了该化合物的体外和体内的抗肿瘤作用。该化合物及其多种结构衍生物在体外对多种组织细胞来源的肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤作用,ICso在10-7-10-8mol/L的范围内。小鼠体内移植瘤实验表明,该化合物的多种给药方案均能够显著地抑制移植肿瘤的生长。由于该化合物的水溶性较差,为改善其溶解性,将其制成了马来酸盐、枸橼酸盐和酒石酸盐等多种盐。体外和体内的药效学研究表明,该化合物的体内外抗肿瘤作用与原型化合物相当或相近。以往的CAT原型化合物只能用羧甲基纤维素钠溶液制成悬液口服给药。成盐后,可注射给予。但由于该药的血管刺激性较强,动物耐受性较差,因此静脉注射给药的效果不佳。药动学上考察了该化合物在血液和脑组织中分布的情况。CAT及其盐给药后,可以透过血脑屏障,进入脑组织。口服给药后5min,脑组织中即可检测到原型化合物。给药后15min,脑组织中出现分布高峰,给药后2h,脑组织中仍能维持一定的药物水平。可见CAT可以透过血脑屏障进入脑组织。这一特性是该化合物的一大优点,这使得该化合物有可能用于治疗脑肿瘤。多数现有的细胞毒类的抗肿瘤药物都是注射给药,可以口服给药的相对较少,而能够口服给药并能够透过血脑屏障进入到脑组织,可治疗脑肿瘤的抗肿瘤药则更少。有文献报道,一些菲并吲哚里西啶类化合物具有神经毒性。为此我们对CAT的神经毒性进行了初步的评价,以考察该化合物是否有神经毒性及出现神经毒性的程度。我们采用大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞神经突触生长试验进行评价,该试验可初步预测化合物的神经毒性。结果发现,与具有神经毒性的已经上市的抗肿瘤药物长春新碱相比,CAT基本不影响大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞的神经突触的生长,因此提示,所用剂量范围内CAT无明显的神经毒性。针对已有的报道和我们实验室前期的研究工作,我们推测菲并吲哚里西啶类化合物CAT可能与核酸(包括DNA和RNA)存在某种相互作用,而核酸本身很可能就是这类药物的重要靶点。因此,我们在实验中对CAT与核酸的相互作用进行了细致地研究。采用圆二色谱法和荧光发射光谱法进行了检测,发现CAT与CT-DNA之间具有直接的、浓度依赖性的相互作用。并且,这种相互作用具有序列特异性。CAT偏好结合富含AT重复序列的DNA片段。以放线菌素D作为阳性对照,应用圆二色谱法检测了四种8bp寡核苷酸序列与CAT的相互作用,发现CAT偏好结合AT重复序列。我们进一步地将8bp序列延长到12bp和20bp,又进一步地证实了这种AT偏好结合的相互作用。我们又采用荧光发射光谱法对这四条8bp寡核苷酸序列与CAT的相互作用进行了检测,结果也证实了这一序列特异性的相互作用。进一步采用14种富含AT序列和缺乏AT的序列进行圆二色谱法及荧光发射光谱法的检测。检测结果也进一步得到证实,CAT与DNA相互作用的AT序列特异性。而且这种相互作用又进一步地被采用DNA粘度检测法证明为嵌入式的相互作用。我们的实验数据还显示CAT与RNA也具有直接的、浓度依赖性的相互作用。CAT的对映异构体-CAT与+CAT仅相差一个手性碳原子的构型,但是体内外活性却相差甚远。我们进一步地采用基因芯片技术和蛋白质组学的方法考察了去氧娃儿藤宁的两个对映异构体对人神经胶质瘤U251细胞的基因表达谱和蛋白表达谱影响的差异。结果发现,差异基因中包含有常规的与细胞凋亡、细胞周期调节、细胞信号转导、细胞生长调节等相关基因。此外,还包括相当多的与DNA复制和损伤修复、转录起始复合物和转录调节及核糖体翻译等相关基因。这些基因的变化与我们前期证明的+CAT能够序列特异性地嵌入到DNA的碱基对之间,以及能够与核糖体RNA直接地相互作用有关。通过蛋白质组学的技术方法找到了一些差异表达的蛋白,这些蛋白与细胞生长和分化调节、分子伴侣、激酶、细胞组成蛋白、能量代谢调节等多种功能有关。总之,CAT作为全新结构母核、作用机制与众不同、植物来源的抗肿瘤新型化合物,具有良好的开发前景。CAT脂溶性好,可口服给药,并可透过血脑屏障,且没有明显的神经毒性。因此,CAT有望开发成为口服治疗脑肿瘤的新型药物。

论文目录

  • 英文缩略词
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 实验材料
  • 一、药品和试剂
  • 二、细胞株及瘤株
  • 三、实验动物
  • 四、主要仪器
  • 实验方法
  • 一、细胞培养
  • 二、MTT法测定肿瘤细胞存活率
  • 三、小鼠体内药效学实验和急性毒性实验
  • 四、大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞体外神经毒性检测
  • 五、小鼠血浆药代动力学及脑组织药物分布实验
  • 六、圆二色谱法检测核酸与配体的相互作用
  • 七、荧光发射光谱法检测核酸与配体的相互作用
  • 八、粘度测定法检测CAT与DNA的相互作用方式
  • 九、分子模拟技术模拟CAT与DNA相互作用的模式
  • 十、基因芯片技术检测CAT的两个对映异构体对基因表达谱影响的差异
  • 十一、双向电泳技术检测CAT的一对对映异构体对蛋白质表达谱影响的差异
  • 十二、统计学处理
  • 实验结果
  • 一、CAT及其衍生物的体外抗肿瘤作用
  • 1. MTT法测定CAT及其衍生物对多种不同组织来源肿瘤细胞的生长抑制作用
  • 2. MTT法测定CAT及其盐对多种不同组织来源的肿瘤细胞生长抑制作用的比较
  • 3. MTT法测定CAT的肝微粒体代谢产物对多种不同组织来源肿瘤细胞的生长抑制作用
  • 二、CAT及其盐和衍生物的体内抗肿瘤作用和初步毒性研究
  • 1. CAT及其盐口服给药对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用
  • 2. 以高剂量间隔口服给药方式给予CAT枸橼酸盐对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用
  • 3. CAT枸橼酸盐静脉注射给药对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用
  • 4. CAT及其衍生物口服给药对小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长抑制作用
  • 5. CAT及三种盐单次口服给药的急性毒性实验
  • 三、CAT的体外初步神经毒性实验
  • 四、CAT及其盐的小鼠血浆药代动力学及脑组织中药物分布研究
  • 五、圆二色谱法检测CAT与DNA的相互作用
  • 1. 圆二色谱法检测CAT与DNA剂量依赖性的相互作用
  • 2. 圆二色谱法检测CAT与DNA相互作用的序列特异性
  • 3. 圆二色谱法检测CAT与启动子区域DNA相互作用的序列特异性
  • 六、荧光发射光谱法检测CAT与DNA的相互作用
  • 1. 荧光发射光谱法检测CAT与DNA之间浓度依赖性的相互作用
  • 2. 荧光发射光谱法测定CAT与DNA相互作用的平衡常数
  • 3. 荧光发射光谱法测定CAT与DNA相互作用的化学计量关系
  • 4. 荧光发射光谱法检测CAT与DNA相互作用的序列特异性
  • 5. 荧光发射光谱法检测CAT与启动子区域DNA相互作用的序列特异性
  • 七、粘度测定法检测CAT与DNA的相互作用方式
  • 1. 粘度测定法检测CAT与线性CT-DNA的相互作用
  • 2. 粘度测定法检测CAT与环状质粒DNA的相互作用
  • 八、分子模拟法模拟DNA与CAT的相互作用方式
  • 九、圆二色谱法检测CAT与RNA的相互作用
  • 十、荧光发射光谱法检测CAT与RNA的相互作用
  • 十一、基因芯片技术检测CAT对人神经胶质瘤U251细胞基因表达谱的影响
  • 十二、蛋白质组学技术检测CAT对人神经胶质瘤U251细胞蛋白表达谱的影响
  • 1. 二维凝胶电泳法检测CAT对人神经胶质瘤U251细胞蛋白表达谱的影响
  • 2. 质谱鉴定结果及生物学分析
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 综述
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历
  • 相关论文文献

    • [1].娃儿藤宁碱诱导肝癌细胞死亡及其作用机制[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2019(09)
    • [2].正交设计优化老瓜头活性成分7-脱甲氧基娃儿藤碱提取工艺研究[J]. 中药材 2015(06)
    • [3].光叶娃儿藤解热抗炎作用实验研究[J]. 中国实验方剂学杂志 2013(04)
    • [4].娃儿藤属(萝藦科)植物花粉器形态[J]. 热带亚热带植物学报 2010(06)
    • [5].光叶娃儿藤镇痛抗炎作用的实验研究[J]. 中国民族民间医药 2012(16)
    • [6].娃儿藤内生真菌Talaromyces purpurogenus次生代谢产物研究[J]. 中国中药杂志 2020(06)
    • [7].7-脱甲氧基娃儿藤碱对小菜蛾的胃毒活性及作用机理初探[J]. 天然产物研究与开发 2015(09)
    • [8].娃儿藤碱(Tylophorine)的全合成研究进展[J]. 阴山学刊(自然科学) 2012(03)
    • [9].7-脱甲氧基娃儿藤碱(DEM)镇痛抗炎作用试验[J]. 中国牛业科学 2019(02)
    • [10].娃儿藤生物碱及其类似物的抗肿瘤构效关系研究进展[J]. 中国药物化学杂志 2010(05)
    • [11].右旋去氧娃儿藤宁纳米结构脂质载体的制备和包封率测定[J]. 中国药师 2019(09)
    • [12].娃儿藤碱类似物DCB-3501的全合成及其细胞毒性[J]. 合成化学 2016(01)
    • [13].娃儿藤生物碱合成的原料(三环母体)的制备[J]. 科技视界 2016(27)
    • [14].娃儿藤内生真菌Diaporthe sp.次生代谢产物研究[J]. 中国中药杂志 2018(14)

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

    菲并吲哚里西啶类生物碱13a-(S)-去氧娃儿藤宁的抗肿瘤作用及机制研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢