虉草耐盐性鉴定及P5CS基因克隆

论文摘要

荫草是多年生草本植物,因具有较强的抗逆性和较高的产量,在欧美国家用于能源草的研究。在本试验中,采用0（CK）、50、100、150、200和250mmol/L6个NaCl浓度梯度,对6份荫草材料的种子萌发和幼苗生长两个阶段进行盐胁迫处理。通过对虉草种子的发芽率、根长、苗长、鲜重及叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量和保护酶活性等生理生化指标的测定,观测其在NaCl胁迫下的一系列生理生化反应。在耐盐性鉴定的基础上选择耐盐性较强的材料Zxy06-2449进行耐盐相关的P5CS基因片段的克隆,并在200mmol/L的盐处理下对其叶片和根系进行定量表达分析,同时测定了各个处理时间点的脯氨酸含量。本研究取得了以下进展：（1）低浓度盐处理对种子萌发及幼苗生长这两个阶段的影响较小,随着NaCl浓度的增高,种子发芽率、根长、鲜重、苗长、叶绿素含量逐渐降低,脯氨酸含量和SOD活性显著增加,丙二醛含量呈先降低后增加的趋势,POD活性没有一致的规律性,CAT活性在盐浓度高于150mmol/L时,所有材料均显著下降。6份荫草材料在种子发芽和幼苗生理变化上均表现出不同的耐盐能力,Zxy06p-2449、 Zxy06p-1904耐盐能力较强,其次为Zxy06p-2380、Zxy06p-2633,Zxy06p-2262和Zxy06p-1916的耐盐性较差。（2）通过同源克隆的方法,从Zxy06p-2449中克隆了P5CS基因片段,共971bp,推导编码323个氨基酸。该P5CS基因序列与小麦和水稻的一致性分别为93%和88%。（3）克隆了虉草Actin基因片段,长度为451bp,作为虉草P5CS基因定量表达的内参。（4）在200mmol/L盐处理下,荧光定量结果表明,叶片中的P5CS基因随着处理时间的延长表达量上调,而根系中的P5CS基因表达量下调。叶片脯氨酸积累趋势与叶片中P5CS基因表达趋势相同,根中脯氨酸含量变化同根中P5CS基因变化基本一致。本研究对荫草种子萌发期和苗期耐盐性进行了鉴定分析,为荫草耐盐性种质的筛选奠定了基础,同时克隆的P5CS基因也为虉草耐盐相关的转基因工程提供了候选基因,另外,克隆的Actin基因可以作为虉草其他基因定量分析时的内参,具有重要的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 综述
• 1.1 虉草的研究进展
• 1.1.1 虉草植物学及生物学特性
• 1.1.2 虉草的品种选育
• 1.1.3 葫草的传统开发利用及生物质能研究
• 1.2 草本植物耐盐性鉴定研究
• 1.2.1 种子萌发及幼苗耐盐能力的鉴定
• 1.2.2 盐胁迫下生理生化鉴定指标研究进展
• 1.3 耐盐相关基因的克隆
• 1.3.1 离子调节相关基因
• 1.3.2 合成渗透调节物质的相关基因
• 1.3.3 与光合作用有关的基因
• 1.3.4 与盐胁迫信号传导有关的基因
• 1.3.5 转录调控因子
• 2 研究目的意义
• 3 试验材料与方法
• 3.1 虉草种子萌发耐盐能力的鉴定
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 种子耐盐萌发
• 3.2 虉草在盐胁迫下生理生化指标的鉴定和分析
• 3.2.1 试验处理
• 3.2.2 测定指标和测定方法
• 3.2.3 数据处理与分析
• 3.3 虉草P5CS基因的克隆
• 3.3.1 试验材料的准备
• 3.3.2 RNA的抽提
• 3.3.3 RNA完整性及纯度检测
• 3.3.4 反转录
• 3.3.5 感受态细胞的制备
• 3.3.6 目的基因片段的获得
• 3.4 盐胁迫下虉草脯氨酸和P5CS基因的表达分析
• 3.4.1 试验材料
• 3.4.2 RNA提取（同3.3.2）
• 3.4.3 DNase Ⅰ处理
• 3.4.4 PCR鉴定g DNA
• 3.4.5 反转录
• 3.4.6 内参Actin基因片段的克隆
• 3.4.7 内参及目的基因的引物设计
• 3.4.8 Real-time PCR
• 3.4.9 脯氨酸含量的测定（同3.2.2.2）
• 4 结果与分析
• 4.1 荫草种子萌发耐盐能力的鉴定
• 4.1.1 NaCl胁迫对虉草发芽率的影响
• 4.1.2 NaCl胁迫对虉草幼苗鲜重的影响
• 4.1.3 NaCl胁迫对虉草发芽种子苗高的影响
• 4.1.4 NaCl胁迫对虉草发芽种子根长的影响
• 4.2 荫草在盐胁迫下生理生化指标的鉴定和分析
• 4.2.1 NaCl胁迫对虉草幼苗脯氨酸含量的影响
• 4.2.2 NaCl胁迫对虉草幼苗丙二醛含量的影响
• 4.2.3 NaCl胁迫对虉草幼苗叶绿素含量的影响
• 4.2.4 NaCl胁迫对虉草幼苗保护酶活性的影响
• 4.3 虉草P5CS基因的克隆
• 4.3.1 RNA的提取与反转录
• 4.3.2 目的基因的克隆
• 4.3.3 测序结果与分析
• 4.4 荫草P5CS基因和脯氨酸在盐胁迫下的表达分析
• 4.4.1 RNA提取
• 4.4.2 内参Actin基因片段的克隆
• 4.4.3 内参及目的基因引物的设计
• 4.4.4 内参基因及目的基因的扩增曲线和溶解曲线的分析
• 4.4.5 盐胁迫下不同处理时间虉草叶片与根系中的P5CS基因表达分析
• 4.4.6 盐胁迫下不同处理时间虉草叶片与根中脯氨酸含量的变化
• 5 小结与讨论
• 5.1 盐胁迫虉草萌发影响
• 5.2 盐胁迫对虉草幼苗生理生化指标的影响
• 5.3 内参基因的选择和特异引物的设计
• 5.4 盐胁迫下虉草P5CS基因与脯氨酸含量变化的相关分析
• 参考文献
• 致谢
• 附图