远志皂苷对Aβ1-40诱导小鼠及PC12细胞痴呆模型保护作用机制的探讨

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种临床上以智能损害为主,并伴有各种精神症状和行为障碍的致死性神经退行性疾病,病理特征表现为神经细胞内出现神经纤维缠结、细胞间出现老年斑（SP）以及神经元大量减少,并且主要分布在与学习记忆密切相关的前皮质和海马区。其发病率逐年上升,但病因和发病机制未明,治疗方法和手段还停留在对症施治阶段,因此需要深入研究其发病的分子机制,以期为治疗AD新药的研发提供新的思路。目的：1.体内实验中研究Aβ1-40对小鼠学习记忆能力、胆碱能系统损害、tau蛋白磷酸化的影响及远志皂苷的保护作用。2.体外实验中研究Aβ1-40对PC12细胞凋亡、tau磷酸化、神经递质相关蛋白的影响及远志皂苷的保护作用。方法：1.体内实验,小鼠单侧海马区脑内立体定位注射凝聚态Aβ1-40制备AD小鼠模型,并用远志皂营灌胃治疗30 d,采用HE染色观察各组小鼠神经元病理形态的改变；通过Morris水迷宫检测各组小鼠的学习记忆能力；采用生化法检测各组小鼠脑组织匀浆中AchE活性的变化；采用免疫组化法观察小鼠ChAT及tau蛋白磷酸化相关蛋白tau、PKA、PP2A表达的变化。2.体外实验,培养PC12细胞, Aβ1-40损伤制备模型,同时远志皂苷共培养干预,MTT法检测各组细胞活力；流式细胞术（FCM）检测各组凋亡率；HE染色对比各组细胞形态变化；免疫组化及免疫荧光观察各组凋亡相关蛋白（Bax, Bcl-2、细胞色素C）、tau蛋白磷酸化相关蛋白（tubulin、tau、PKA、PP2A）、神经递质相关蛋白（ChAT、突触素、M1受体）的表达情况。结果：1.体内实验中,与模型组相比,高、中剂量组小鼠逃逸潜伏期明显缩短,游泳路程显著变短,穿越平台次数明显增加,海马、皮层神经细胞数量增多,同时脑内AchE活性降低,ChAT的阳性表达均增加,差异均具有统计学意义（P<0.01、P<0.05）,而低剂量组差别不显著（P>0.05）：2.体内实验中,与模型组比较,高中低剂量组tau蛋白、PKA表达量明显减少,PP2A表达量增加明显,差异均具有统计学意义（P<0.01、P<0.05）；3.体外实验中,与模型组相比,高、中剂量组细胞活力明显提升,凋亡率明显减少,bax/bcl-2的比值明显变小,细胞色素C表达量降低,差异均具有统计学意义（P<0.01、P<0.05）,而低剂量组变化只有改变的趋势（P>0.05）；4.体外实验中,与模型组相比,高、中剂量组tau蛋白、PKA表达的阳性细胞率显著降低,而tubulin.PP2A.M1受体、ChAT、突触素等阳性细胞所占的比例明显升高,差异均具有统计学意义（P<0.01、P<0.05）,低剂量组改变不明显。结论：1.远志皂苷能减轻Aβ1-40对神经细胞的毒害,通过调节AchE和ChAT活性,间接增加Ach含量来改善AD小鼠的学习记忆功能；2.远志皂苷可以通过上调PP2A,下调PKA,平衡tau的磷酸化程度,从而缓解神经纤维缠结；3.体外实验中,远志皂苷可能通过调节Bax、Bcl-2、Cyt-C等凋亡蛋白的表达来抑制细胞凋亡,减轻Aβ1-40对PC12细胞的毒害；4.体外实验中,远志皂苷能够调节PKA和PP2A的表达,减少tau蛋白的含量,增加tubulin的表达,表明其可以缓解tau蛋白的过度磷酸化,保护神经元的细胞骨架系统,进而推断远志皂苷能够减轻AD患者脑内神经元的神经纤维缠结、保护神经元骨架系统的物质转运功能；5.体外实验中,远志皂苷能增加Aβ1-40损伤的PC12细胞的M1受体.ChAT的表达量以及突触素密度,表明其可以改善受损神经元的胆碱能系统。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 前言
• 1-40诱导小鼠痴呆模型保护作用机制的探讨'>第一部分 远志皂苷对AB_1-40诱导小鼠痴呆模型保护作用机制的探讨
• 一、远志皂苷对AD小鼠行为学及神经细胞病理形态的影响
• 1. 材料
• 1.1 动物
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 仪器
• 2. 方法
• 1-40的体外孵育'>2.1 Aβ_1-40的体外孵育
• 2.2 试剂的配制
• 2.3 动物模型的制作
• 2.4 药物干预
• 2.5 小鼠行为学观察
• 2.6 常规病理学检测
• 2.7 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 小鼠行为学观察
• 4 讨论
• 二、远志皂苷对AD小鼠胆碱能系统功能的影响
• 1. 材料
• 1.1 动物
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 主要仪器
• 2. 方法
• 1-40的体外孵育'>2.1 Aβ_1-40的体外孵育
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 动物模型的制作
• 2.4 药物干预
• 2.5 乙酰胆碱酯酶活性的测定
• 2.6 ChAT免疫组化染色
• 2.7 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 乙酰胆碱酯酶活性的测定
• 3.2 ChAT表达的变化
• 4. 讨论
• 三、远志皂苷对AD小鼠大脑神经细胞TAU蛋白磷酸化的影响
• 1. 材料
• 1.1 药品和试剂
• 1.2 仪器
• 2. 方法
• 2.1 Tau蛋白免疫荧光
• 2.2 PKA免疫组化染色
• 2.3 PP2A免疫组化染色
• 2.4 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 tau蛋白表达量的变化
• 3.2 PKA表达量的变化
• 3.3 PP2A表达量的变化
• 4. 讨论
• 1-40损伤PC12细胞保护作用机制的探讨'>第二部分 远志皂苷对AB_1-40损伤PC12细胞保护作用机制的探讨
• 1-40损伤PC12细胞凋亡的抑制作用'>一、远志皂苷对AB_1-40损伤PC12细胞凋亡的抑制作用
• 1. 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 仪器
• 2. 方法
• 1-40孵育'>2.1 Aβ_1-40孵育
• 2.2 药品的配制
• 2.3 细胞的培养
• 2.4 细胞给药处理及分组
• 2.5 MTT检测各组细胞活力
• 2.6 流式细胞仪检测凋亡率
• 2.7 HE观察细胞病理学改变
• 2.8 Bcl-2免疫组化
• 2.9 Cyt-c和Bax表达的免疫荧光检测
• 2.10 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 MTT
• 3.2 流式细胞仪
• 3.3 HE染色
• 3.4 Bax、Bcl-2免疫组化
• 3.5 细胞色素C表达的免疫荧光观察
• 4. 讨论
• 1-40损伤PC12细胞TAU蛋白磷酸化的影响'>二、远志皂苷对AB_1-40损伤PC12细胞TAU蛋白磷酸化的影响
• 1. 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 仪器
• 2. 方法
• 2.1 tau+PP2A免疫荧光双标记
• 2.2 PKA+PP2A免疫荧光双标记
• 2.3 tau+tubulin免疫荧光双标记
• 2.4 图片合成
• 3. 结果与分析
• 3.1 tau+PP2A免疫荧光双标记
• 3.2 PKA+PP2A免疫荧光双标记
• 3.3 tau+tubulin免疫荧光双标记
• 4. 讨论
• 三、远志皂苷对PC12细胞中cAMP信号通路中相关靶蛋白表达的影响
• 1. 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 药品和试剂
• 1.3 仪器
• 2. 方法
• 2.1 ChAT表达的免疫荧光检测
• 1+S_yn免疫荧光双标记'>2.2 M₁+S_yn免疫荧光双标记
• 2.3 统计分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 ChAT免疫荧光
• 1+Syn免疫荧光双标记'>3.2 M₁+Syn免疫荧光双标记
• 4. 讨论
• 总结
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 作者简介
• 致谢