OsRMC基因调控水稻根生长发育的机理研究

论文摘要

实验室前期工作证明OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达,可以抑制水稻初生根的生长,促进不定根的形成,形成不同程度螺旋状的初生根,根的向地性反应减缓,这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似,而且OsRAA1基因的转录受生长素诱导,这些结果表明OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。但这些表型产生的机理还不是很清楚。在水稻中,茉莉酸在根发育过程中的作用多为生理实验的报道;拟南芥中的研究表明生长素信号转导和茉莉酸信号转导可能都受26S蛋白酶体的调控。由此我们推测茉莉酸在根的发育过程中可能也起着同样的促进作用。本论文在超表达OsRAA1水稻基础上旨在克隆新基因,并对新基因功能进行研究,以探讨茉莉酸在水稻根发育过程中的分子机理,并对生长素和茉莉酸信号转导的关系进行探讨。首先运用双向电泳技术结合质谱分析技术,在超表达OsRAA1水稻背景下发现了受体激酶家族DUF26的一个成员明显下调,我们命名为OsRMC（Oryza sativa Root Meander and Curling,AAL87185）,Western杂交进一步证明了这个结果。OsRMC位于4号染色体,信息学分析表明只有一个拷贝,没有内含子,ORF阅读框为777bp,编码的蛋白分子量为27.9 kDa,等电点（pI）为5.01。对该蛋白进行同源性比较发现,其含有2个C-X8-C-X2-C基序（Cys-rich repeat, CRR）即半胱氨酸富集区,其中第四个半胱氨酸残基不保守,该基序会形成二硫键,编码两个未知功能的DUF26（Domain Unknown Function 26）结构域。OsRMC由一个信号肽和两个CRR区组成,但没有跨膜区和激酶区。RT-PCR显示OsRMC可能是组成型表达的基因;亚细胞实验表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot显示OsRMC受茉莉酸诱导表达,受生长素的抑制。RNAiOsRMC转基因水稻在暗处培养时,抑制了初生根的生长,使侧根数目减少,但促进了不定根的生长和数目的增加;第二叶鞘变短,这些表型和前人报道的外源茉莉酸处理野生型的表型一致。转基因对生长素信号转导和合成没有影响,但初生根和第二叶鞘对外源茉莉酸更加敏感,说明RNAiOsRMC转基因水稻可能增强了茉莉酸信号转导途径。分析转基因水稻的茉莉酸信号转导途径部分相关基因的表达变化,根中受茉莉酸信号转导特异诱导的病原相关基

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语英汉对照
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 植物激素在水稻根发育中的研究
• 1.2.1 茉莉酸作用的分子机理研究
• 1.2.2 其他植物激素在水稻根发育过程中分子生物学研究
• 1.2.3 展望
• 1.3 植物类受体激酶蛋白的研究进展
• 1.4 双向电泳研究策略
• 1.4.1 蛋白质组学研究方法
• 1.4.2 蛋白质组学在水稻中的应用
• 1.4.3 展望
• 1.5 博士论文立题依据与研究策略
• 1.5.1 研究背景
• 1.5.2 研究内容与研究策略
• 1.5.3 科学目标
• 第二章 OsRMC 基因的克隆和表达分析
• 第一节 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 工具酶及主要试剂
• 1.4 仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 相关基本分子生物学操作
• 2.1.1 细菌的培养和菌种的保存
• 2.1.2 大肠杆菌热击转化感受态的制备和转化
• 2.1.3 质粒抽提
• 2.1.4 核酸电泳
• 2.1.5 凝胶回收
• 2.1.6 农杆菌电击感受态制备和转化
• 2.2 双向电泳
• 2.2.1 蛋白的提取
• 2.2.2 电泳
• 2.2.3 凝胶图象分析
• 2.2.4 蛋白质胶内消化
• 2.2.5 差异蛋白的肽质量指纹谱分析
• 2.2.6 数据检索
• 2.3 OsRMC 基因克隆
• 2.3.1 水稻Total RNA 的提取
• 2.3.2 RT-PCR 分离OsRMC 基因
• 2.4 原核表达融合蛋白
• 2.4.1 表达载体构建
• 2.4.2 GST-OsRMC 融合蛋白的诱导表达
• 2.4.3 GST-OsRMC 蛋白的纯化
• 2.5 OsRMC 抗体的制备
• 2.6 Western blot 分析
• 2.6.1 水稻蛋白的提取
• 2.6.2 蛋白电泳和Western blot 检测
• 2.7 OsRMC 表达模式
• 2.7.1 RT-PCR 分析OsRMC 组织表达特异性
• 2.7.2 DIG 标记探针的原位杂交
• 第二节 结果与分析
• 1. 超表达OsRAA1 水稻根的蛋白组分析
• 2. 基因OsRMC 的克隆和序列分析
• 3.W estern blot 检测双向电泳的结果
• 3.1 融合蛋白的原核表达和抗体制备
• 3.2 Western blot 检测
• 4.05 RMC 的表达模式变化
• 4.1 OsRMC 的表达组织特异性
• 4.2 RNA 原位杂交
• 第三章 OsRMC 生理功能研究
• 第一节 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 工具酶、试剂及主要仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 载体RNAiOsRMC 对农杆菌的转化
• 2.1.1 RNAiOsRMC 载体的构建
• 2.1.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.3 重组质粒对农杆菌的转化
• 2.1.4 农杆菌阳性克隆的鉴定
• 2.2 根癌农杆菌介导的水稻转化
• 2.2.1 幼胚愈伤组织的诱导
• 2.2.2 共培养及转化、筛选、分化
• 2.3 转基因植株的鉴定
• 2.3.1 转化植株的组织化学分析
• 2.3.2 转基因水稻植株分子鉴定
• 2.4 OsRMC-GFP 亚细胞定位
• 2.4.1 载体构建
• 2.4.2 载体p81121GFP-OsRMC 对农杆菌的转化
• 2.4.3 农杆菌介导的拟南芥转化
• 2.4.4 OsRMC-GFP 亚细胞定位观察
• 2.5 OsRAA1-GFP 亚细胞定位
• 2.5.1 pGFP221-OsRAA1 载体构建
• 2.5.2 基因枪轰击
• 2.5.3 荧光显微镜观察
• 2.6 酵母双杂分析OsRMC 与OsRAA1 的互作
• 2.6.1 质粒载体的构建
• 2.6.2 酵母感受态细胞的制备
• 2.6.3 LiAc 介导的质粒向酵母细胞的小规模转化
• 2.6.4 半乳糖苷酶活性检测
• 2.7 转基因水稻的表型观察
• 2.7.1 激素及抑制剂处理转基因水稻
• 2.7.2 茉莉酸和生长素对OsRMC 表达的影响
• 2.7.3 光照对OsRMC 表达的影响
• 2.7.4 茉莉酸信号转导途径标记基因的RT-PCR
• 2.7.5 根向地性分析
• 2.7.6 生长素含量的测定
• 2.7.7 PI 染色观察根细胞
• 2.7.8 根尖细胞有丝分裂周期的观察
• 2.7.9 胁迫处理
• 第二节 结果与分析
• 1.R NAiOsRMC 转基因水稻表型观察
• 2. 转基因水稻分子鉴定
• 3.R NAiOsRMC 转基因水稻初生根表型分析
• 3.1 转基因水稻根细胞大小的变化
• 3.2 转基因水稻根尖细胞有丝分裂周期的分析
• 4 茉莉酸和生长素对OsRMC 表达的影响
• 4.1 RNAiOsRMC 转基因水稻根对生长素的响应
• 4.2 RNAiOsRMC 转基因水稻对茉莉酸的响应
• 4.2.1 黑暗条件下根对茉莉酸响应的分析
• 4.2.2 光照条件下根对茉莉酸响应的分析
• 4.2.3 第二叶鞘对茉莉酸响应的分析
• 4.2.4 转基因水稻对茉莉酸信号转导途径和合成途径部分基因的影响
• 5. RNAiOsRMC 转基因水稻向地性分析
• 6. RNAiOsRMC 转基因水稻对盐和干旱胁迫的响应变化
• 7. OsRMC 与OsRAA1 互作分析
• 7.1 OsRMC-GFP 亚细胞定位
• 7.2 OsRAA1-GFP 的亚细胞定位
• 7.3 OsRMC 与OsRAA1 的酵母双杂
• 8. 茉莉酸和生长素对水稻根发育影响的比较分析
• 第四章 讨论
• 1. OsRMC 是膜定位的蛋白
• 2. OsRMC 是茉莉酸信号转导的负调控因子
• 3. OsRMC 参与根弯曲和卷曲过程的调控
• 4. 茉莉酸信号转导受生长素信号转导的影响
• 第五章 论文结论
• 1. 研究特色与创新之处
• 2. 主要结论
• 3. 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 致谢