肝素等硫酸多糖与粒细胞集落刺激因子等蛋白质在分子和细胞水平上的相互作用研究

论文摘要

肝素等硫酸多糖是一类重要的生物分子,它通过与蛋白质相互作用在许多生物学过程中起着重要作用,如信号传导、细胞生长与分化等。研究此类相互作用对深入理解生物和生理过程有重要意义,并对以糖为基础的新药研发有促进作用。本文以毛细管电泳（CE）为主要技术平台,结合高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）和流式细胞术等系统研究了肝素等硫酸多糖与粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等蛋白质的相互作用。利用毛细管区带电泳（CZE）研究了不同类型蛋白质与肝素的相互作用。发现CZE既可研究动力学上慢速解离平衡体系,又可研究快速解离平衡体系,扩展了CZE的应用范围。发现粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子与肝素的相互作用具有特异性,并首次测定了结合常数。利用CZE系统研究了不同分子量、不同来源及不同硫酸化位点的肝素和G-CSF的相互作用,进行了定性和定量测定。首次发现G-CSF能和肝素结合,且结合的强弱与肝素的链长、来源及硫酸化位点有关。发展了一种既适于分离肝素寡糖、又适于研究肝素与蛋白质相互作用的方法。首次在肝素寡糖分离基础上研究其与蛋白质的相互作用,并找到了与G-CSF结合的组分。该方法勿须加入任何添加剂,即可在正向分离模式下使一种肝素酶降解肝素所得寡糖快速达到基线分离。对该寡糖进行了定性研究,未发现三硫酸化二糖,表明所用肝素酶可选择性的降解肝素。用HPLC和MS对该寡糖进行进一步分离和鉴定,得出了各肝素二糖的分子量,与CE所得结果一致。作为肝素的扩充,研究了其它硫酸聚糖和G-CSF的相互作用,并对硫酸聚糖的结构对相互作用的影响进行了定性定量考察。发现糖链长度和硫酸化程度是其与G-CSF相互作用的关键因素。在上述分子水平研究的基础上,将G-CSF与其结合多糖作用于G-CSF依赖鼠髓白血病细胞株,NFS-60。用流式细胞术等多种生物学方法研究了作用后细胞的增值、分化及细胞周期变化等。首次发现了三种硫酸多糖能显著抑制NFS-60细胞生长并诱导其分化为成熟细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 肝素等硫酸多糖的分离及其与蛋白质的相互作用研究（文献综述）
• 1.1 引言
• 1.2 肝素等硫酸多糖的结构和生物活性
• 1.3 肝素及其寡糖的分离分析
• 1.3.1 肝素及其寡糖的毛细管电泳（CE）分离
• 1.3.1.1 分离模式
• 1.3.1.2 未衍生肝素及其寡糖的 CE 分离
• 1.3.1.2.1 肝素的降解方法
• 1.3.1.2.2 CE 分离
• 1.3.1.3 肝素及其寡糖衍生物的 CE 分离
• 1.3.1.3.1 衍生化方法
• 1.3.1.3.2 CE 分离
• 1.3.2 肝素及其寡糖CE 分析的检测方法
• 1.3.2.1 UV/间接 UV（IUV）检测
• 1.3.2.2 LIF / 间接 LIF（ILIF）检测
• 1.3.2.3 MS 检测
• 1.4 肝素等硫酸多糖与蛋白质的相互作用及其研究方法
• 1.4.1 肝素等硫酸多糖与蛋白质相互作用的 CE 研究
• 1.4.1.1 平衡样品混合物的非平衡电泳
• 1.4.1.1.1 CZE
• 1.4.1.1.2 FA/FACCE
• 1.4.1.1.3 VP
• 1.4.1.2 动态平衡亲和电泳
• 1.4.1.2.1 ACE
• 1.4.1.2.2 HD
• 1.4.1.3 CEC
• 1.4.2 肝素与蛋白质相互作用 CE 研究的应用
• 1.4.2.1 活性筛选
• 1.4.2.2 手性拆分
• 1.4.2.3 结构-功能研究
• 1.5 展望
• 1.6 本文研究思路、所涉及的相互作用体系及其它研究工作
• 参考文献
• 第二章 肝素和蛋白质相互作用的一般性研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 样品制备
• 2.2.3 毛细管区带电泳
• 2.3 结果
• 2.3.1 LMWH 的加入对样品进样量的影响
• 2.3.2 EGF 与肝素相互作用的CZE 研究
• 2.3.3 AT-III 与LMWH 相互作用的CZE 研究
• 2.3.4 IL-2 和LMWH 相互作用的CZE 研究
• 2.3.5 ApoE2 与LMWH 相互作用的CZE 研究
• 2.3.6 GM-CSF 和肝素/LMWH 相互作用的 CZE 研究
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 肝素与粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的相互作用研究
• 3.1 肝素/低分子量肝素与G-CSF 相互作用的CZE 研究
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 实验部分
• 3.1.2.1 试剂
• 3.1.2.2 仪器和实验步骤
• 3.1.3 结果和讨论
• 3.1.3.1 涂柱和非涂柱的比较
• 3.1.3.2 离子强度对 G-CSF 分离的影响
• 3.1.3.3 肝素和 G-CSF 的相互作用研究
• 3.1.3.4 LMWH 和G-CSF 的相互作用研究
• 3.1.3.5 肝素—G-CSF、LMWH—G-CSF 相互作用的比较
• 3.1.4 小结
• 3.2 各种修饰肝素与 G-CSF 相互作用的 CZE 研究
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 实验部分
• 3.2.2.1 试剂
• 3.2.2.2 仪器和实验步骤
• 3.2.3 结果和讨论
• 3.2.3.1 G-CSF 与不同来源LMWH 的相互作用研究
• 3.2.3.2 G-CSF 与N-位去硫酸化肝素的相互作用研究
• 3.2.3.3 G-CSF 与2,3-O-位去硫酸化肝素的相互作用研究
• 3.2.4 小结
• 3.3 肝素寡糖的CE、HPLC 分离、MS 鉴定及与 G-CSF 的相互作用研究
• 3.3.1 引言
• 3.3.2 实验部分
• 3.3.2.1 试剂
• 3.3.2.2 肝素寡糖的制备
• 3.3.2.3 肝素寡糖的 GPC 分析
• 3.3.2.4 肝素寡糖的 CE 分析
• 3.3.2.5 肝素寡糖的 SAX-HPLC 分离及 ESI-MS 鉴定
• 3.3.2.6 肝素寡糖与 G-CSF 相互作用的 CZE 研究
• 3.3.3 结果
• 3.3.3.1 肝素寡糖的 GPC 分析
• 3.3.3.2 肝素寡糖的 CE 分离和鉴定
• 3.3.3.3 肝素寡糖的 HPLC 分离和 ESI-MS 鉴定
• 3.3.3.4 肝素寡糖和 G-CSF 的相互作用研究
• 3.3.3.4.1 甘露醇和pH 对肝素寡糖分离的影响
• 3.3.3.4.2 寡糖馏分 I 与 G-CSF 的相互作用
• 3.3.3.4.3 寡糖馏分 K 与 G-CSF 的相互作用
• 3.3.4 讨论
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 其它硫酸多糖与 G-CSF的相互作用研究
• 4.1 卡拉胶与G-CSF 相互作用的CZE 研究
• 4.1.1 引言
• 4.1.2 实验部分
• 4.1.2.1 试剂
• 4.1.2.2 仪器和实验步骤
• 4.1.3 结果和讨论
• 4.1.3.1 孵育时间对 G-CSF-卡拉胶相互作用的影响
• 4.1.3.2 G-CSF 和λ卡拉胶的相互作用研究
• 4.1.3.3 卡拉胶硫酸化程度
• 4.1.4 小结
• 4.2 硫酸葡聚糖与G-CSF 相互作用的CZE 研究
• 4.2.1. 引言
• 4.2.2 实验部分
• 4.2.2.1 试剂
• 4.2.2.2 仪器和实验步骤
• 4.2.3 结果
• 4.2.3.1 G-CSF 和DS500 的相互作用研究
• 4.2.3.2 G-CSF 和DS40/DS8 的相互作用研究
• 4.2.3.3 G-CSF 和葡聚糖的相互作用研究
• 4.2.4 讨论
• 4.3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 硫酸多糖-G-CSF体系和白血病细胞NFS-60相互作用的初步考察
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 细胞系
• 5.2.3 细胞增殖研究方法
• 5.2.4 细胞分化研究方法
• 5.2.5 细胞周期分析
• 5.2.6 统计学分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 硫酸多糖-G-CSF 体系对 NFS-60 细胞增殖的影响
• 5.3.2 硫酸多糖-G-CSF 体系对 NFS-60 细胞分化的影响
• 5.3.3 硫酸多糖-G-CSF 体系对 NFS-60 细胞周期的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 总结论
• 作者简介及发表文章目录
• 致谢