Adipose介导的C2C12成肌分化及TNF-α调控作用研究

论文摘要

肌细胞分化与动物肉质相关,也与人类的一系列疾病,如心脏病,肌肉萎缩等相关。Adipose （adp）基因编码一种在进化上保守的蛋白质,在组织中广谱表达。该基因最初在肥胖果蝇突变体中发现,Adp突变果蝇高效储存脂肪,在饥饿条件下可增加果蝇存活率高,但目前对其功能了解甚少。本文以C2C12成肌细胞为模型,构建了C2C12稳转表达ADP的细胞系,采用RT-PCR、Western Blot以及免疫细胞染色等方法,较系统的研究ADP对C2C12成肌分化的影响以及脂肪细胞因子TNF-α对ADP介导的C2C12成肌分化的调控作用。获得如下研究结果：1.ADP表达量随C2C12的成肌分化呈上升态。2.稳转表达ADP细胞系分化时间提前,分化程度更高,成肌标志因子MHC的mRNA和蛋白表达量明显高于对照,表明ADP可以促进C2C12成肌分化。3.检测稳转表达ADP细胞系分化过程中成肌相关因子Myf5, MyoD1, MyoG, Mef2c表达变化发现,只有MyoG在稳转表达ADP细胞系中的表达明显高于对照组。C2C12细胞中超表达ADP和敲减ADP后,MyoG表达量呈显著变化。证明ADP可能是通过MyoG介导促进C2C12的成肌分化。4. TNF-α刺激稳转表达ADP细胞系,分化2天后检测显示：TNF-α刺激后显著地降低了MHC、ADP及KLF15的表达量,免疫细胞染色也显示TNF-α显著地降低了肌管数量。结果证明脂肪细胞因子TNF-α可抑制ADP对C2C12分化的促进作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 成肌分化
• 1.1 胚胎成肌过程
• 1.2 胚胎成肌分化调控
• 1.3 卫星细胞分化过程和调控
• 1.4 HDACS与成肌分化
• 2 ADP的结构及其功能
• 2.1 ADP概述
• 2.2 WD40结构域
• 2.3 TPR结构域
• 2.4 ADP的功能
• 3 TNF-α与成肌分化
• 4 研究目的和意义
• 第二章 实验材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验细胞
• 1.2 载体和菌株
• 1.3 主要仪器及厂家
• 1.4 主要试剂
• 1.4.1 载体构建相关试剂
• 1.4.2 细胞相关试剂
• 1.4.3 RNA相关试剂
• 1.4.4 蛋白相关试剂
• 1.5 主要溶液配制
• 1.5.1 常用培养基
• 1.5.2 制备感受态相关试剂配制
• 1.5.3 琼脂糖电泳相关溶液配制
• 1.5.4 质粒抽提相关溶液配制
• 1.5.5 细胞培养相关试剂配制
• 1.5.6 Western blot相关溶液配制
• 1.5.7 细胞免疫染色相关溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 基因克隆
• 2.1.1 CDS模板序列的制备
• 2.1.2 AT克隆
• 2.1.3 真核表达载体的构建
• 2.2 细胞培养和转染
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 瞬时转染
• 2.2.3 Adp稳定转染C2C12细胞筛选
• 2.3 细胞分化
• 2.3.0 C2C12细胞分化
• 2.3.1 稳转adp的C2C12细胞分化
• 2.3.2 加TNF-α稳转adp的C2C12细胞分化
• 2.4 实时荧光定量PCR
• 2.5 Western Blot
• 2.5.1 蛋白质样品的制备
• 2.5.2 SDS-PAGE电泳
• 2.5.3 转膜
• 2.5.4 杂抗体
• 2.6 免疫荧光染色
• 2.7 基因敲减方法
• 2.8 分子生物学及相关软件
• 2.8.1 Primer Premier 5.0及Oligo 6进行引物设计及酶切位点确认
• 2.8.2 GraphPad Prism 5及CFX manager数据处理软件
• 第三章 结果和分析
• 1 ADP与C2C12成肌分化
• 1.1 C2C12细胞诱导分化
• 1.2 ADP以及成肌相关重要因子在C2C12分化过程中的表达
• 2 ADP对C2C12成肌分化的影响
• 2.1 Adp稳转C2C12细胞系检测
• 2.2 稳转细胞系诱导分化
• 2.3 ADP以及MHC在稳转细胞系分化过程中的表达
• 3 ADP对MyoG表达调控
• 3.1 成肌重要因子在稳转细胞分化过程中的表达
• 3.2 超表达ADP对MyoG表达的影响
• 3.3 敲减ADP后MyoG的表达情况
• 4 TNF-α对ADP介导的成肌分化调控
• 4.1 TNF-α对稳转细胞成肌分化过程中ADP和KLF15表达的影响
• 4.2 TNF-α对稳转细胞成肌分化的影响
• 第四章 讨论
• 第五章 结论、创新与不足之处
• 1 结论
• 2 创新
• 3 不足
• 参考文献
• 致谢