玉米低温和干旱诱导型启动子的克隆及功能分析

论文摘要

低温、干旱等逆境是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子,严重的影响植物的产量。每年全球主要农作物的产量损失约有50%是由非生物胁迫导致的。玉米是我国三大粮食作物之一,属于逆境敏感型植物,生育期内极易受低温、干旱、盐渍等多元逆境胁迫的干扰和伤害,解决玉米生产中严重的多元逆境胁迫问题,提高玉米产量,除了常规育种技术以外,基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。通过转基因技术提高玉米抗逆性是有效应对逆境挑战的根本途径,而分离、克隆抗逆关键基因是解决这一重要问题的核心与关键,克隆和组建逆境交叉诱导型启动子是进行玉米多抗基因转化实现分子育种目标的重要保障。诱导型启动子可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官和生长环境下,诱导基因的大量表达,应答外界环境的变化。避免了植物营养的不必要浪费。近年来,为了提高植物的抗逆性,许多启动子和抗逆基因被克隆,但是玉米的逆境诱导型启动子研究较少。本研究从玉米中分离了低温、干旱诱导型启动子（LsP）,并构建了植物表达载体,转化农杆菌,并对其活性进行了初步验证,为以后开展利用转基因技术改良玉米抗逆品质研究奠定基础。本研究结果如下:（1）从玉米基因组中分离了low temperature and salt responsive protein（LS）基因ATG上游1735bp的调控序列,命名为LsP。并通过启动子分析软件,对其顺式作用元件进行分析。（2）构建了该启动子的植物双元表达载体pCAMBIA1301-LsP,用叶盘转化法转化烟草。对烟草的抗性芽进行GUS染色,初步证明该启动子具有低温诱导活性。得到了转基因的烟草,并且对转基因烟草进行200mmol/LNaCl、4℃和20%PEG诱导后进行GUS染色,发现该启动子受低温和干旱诱导。（3）为寻找该启动子的核心序列,构建了4个5′-端渐变缺失载体。通过瞬时表达进行初步研究。GUS荧光定量分析发现在-1845bp-1173bp之间存在着一些负调控元件降低基因表达,在-543bp-110bp之间存在该启动子的核心序列。在-1173bp-810bp之间片段中可能存在着低温诱导响应元件,在-810bp-543bp之间处可能存在干旱响应元件。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 玉米的概述
• 1.1.1 低温对玉米影响
• 1.1.2 干旱对玉米的影响
• 1.2 植物抗逆基因工程研究进展
• 1.2.1 植物对非生物胁迫的应答机制
• 1.2.2 植物抗逆相关基因研究进展
• 1.3 植物启动子研究进展
• 1.3.1 植物启动子的结构和功能
• 1.3.2 植物基因启动子类型及应用
• 1.3.3 启动子分离及功能分析方法
• 1.4 本研究的目的意义、内容
• 1.4.1 本研究的目的意义
• 1.4.2 本研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要溶液和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 Ls 基因启动子的分离
• 2.2.2 植物双元表达载体构建
• 2.2.3 植物双元表达载体转化农杆菌EHA105
• 2.2.4 叶盘法转化烟草
• 2.2.5 转基因烟草验证
• 2.2.6 GUS组织化学染色
• 2.2.7 胁迫处理
• 2.2.8 GUS定量分析
• 2.2.9 5′-端渐变缺失载体构建
• 2.2.10 5′-端渐变缺失载体在烟草中的瞬时表达活性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米逆境诱导型启动子（LsP）克隆与分析
• 3.1.1 玉米逆境诱导型启动子（LsP）克隆
• 3.1.2 玉米逆境诱导型启动子（LsP）分析
• 3.2 pCAMBIA1301-LsP植物表达载体构建及功能验证
• 3.2.1 pCAMBIA1301-LsP植物表达载体构建
• 3.2.2 pCAMBIA1301-LsP转化农杆菌EHA105
• 3.2.3 叶盘法转化烟草及GUS 染色结果
• 3.3 转基因烟草筛选及验证
• 3.3.1 转基因烟草筛选
• 3.3.2 转基因烟草验证
• 3.3.3 对转基因植株进行之不同处理后组织化学染色
• 3.4 pCAMBIA1301-LsP5′-端缺失表达载体构建
• 3.4.1 5′-端缺失片段克隆
• 3.4.2 pCAMBIA1301-LsP 5′-端缺失表达载体构建
• 3.5 pCAMBIA1301-LsP5′-端缺失表达载体转化农杆菌
• 3.6 缺失载体在烟草中瞬时表达的GUS 定量分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢