内切-1，4-β-葡聚糖酶基因转化棉花及转基因植株的再生研究

论文摘要

棉纤维是纺织工业的重要原料，在国民经济中占有重要地位。因此，从分子水平阐明棉纤维发育的机理，具有重要的理论价值和现实意义。本研究利用一个与拟南芥KORRIGAN基因（编码跨膜内切-1，4-β-葡聚糖酶）高度同源的棉花基因GhCEL（GenBank accession number：AY574906）成功地构建了该基因的RNAi表达载体和正义表达载体，将上述两个表达载体通过农杆菌介导法分别转入棉花，试图阐明该基因的过量表达和抑制表达对受体棉花植株及其棉纤维品质的作用，为今后进一步将该基因应用于植物的遗传改良奠定基础。主要结果如下：1．棉花遗传转化体系的优化研究结果表明，在以下胚轴作为受体的棉花遗传转化体系中，转化初期将愈伤诱导培养基中的KNO3加倍，有利于愈伤的起动和增殖；潮霉素筛选的起始浓度为5mg/L最佳，而在愈伤生长和增殖阶段，潮霉素浓度可增加到10mg/L，然后经过2～3次继代即可去掉潮霉素，有利于愈伤的生长和分化。2．目的基因的转化及胚性愈伤系的获得利用根癌农杆菌介导转化法将构建的GhCEL基因的RNAi表达载体和正义表达载体分别转入棉花受体W0中，在筛选培养基中当抗性愈伤长到直径为0.5cm左右时将其从外植体上剥离下来，转入含10mg/L潮霉素的培养基上继续培养，待生长至直径为1.0cm左右即转入胚性愈伤诱导培养基中，总共获得了62个分化的抗性愈伤系。经过GUS检测和PCR验证，其中有阳性愈伤系42个，平均阳性率为67.7％。3．转化植株的分子检测总共获得转基因再生植株300多株，用Hpt基因特异引物对其中的239株进行了PCR检测，初步确定190株为阳性，阳性率为79.5％。110株转正义基因的再生植株除了用Hpt基因特异引物扩增外，还设计了启动子-基因特异引物进行扩增。结果表明，两种引物扩增得到的阳性率有较大差异，用启动子-基因特异引物扩增的阳性率为52.7％，远远低于Hpt基因特异引物扩增得到的阳性率79.1％。只有两次PCR扩增结果都为阳性的植株才被初步认为是转基因植株。以Hpt基因片段作为探针，随机取转RNAi基因的T0代7株PCR阳性植株做Southern杂交。结果证明Hpt基因已经整合到植物基因组中。4．转基因植株的嫁接和移栽总共嫁接了50株转RNAi基因的植株，成活35株，成活率可达70％以上。而移栽的20株再生苗最后成活的只有4株，成活率不到20％。转RNAi基因T0代植株与受体W0的再生植株相比，株型除了个别的变得比较紧凑外，大部分没有太大的变化；但是T0代的纤维都比对照的短。转基因棉花的株型及其纤维品质变化原因还有待进一步的研究和分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 引言
• 1 RNA干涉的机制及其在植物基因工程中的应用
• 1.1 RNAi的作用机制
• 1.1.1 小干涉RNA介导同源RNA降解
• 1.1.2 RNA介导同源DNA甲基化（RdDM）
• 1.1.3 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）模型
• 1.2 RNA介导的基因沉默在植物基因工程中的应用
• 2 棉花遗传转化技术研究
• 2.1 农杆菌介导法
• 2.2 基因枪法
• 2.3 农杆菌法和基因枪法结合的转化方法（简称农杆枪法）
• 2.4 花粉管通道法
• 2.5 选择标记基因
• 2.6 报告基因
• 3 棉花遗传转化的主要成就
• 3.1 转基因抗虫棉
• 3.2 转基因抗除草剂棉
• 3.3 转基因抗病棉
• 3.4 转基因抗盐棉
• 3.5 转基因杂种棉
• 3.6 转基因抗逆棉
• 4 棉花纤维品质的转基因育种现状
• 4.1 棉纤维发育基因的克隆
• 4.2 外源纤维基因的导入与棉纤维品质的改良
• 4.2.1 激素基因与棉纤维改良
• 4.2.2 phbB,phbC基因与棉纤维的保暖性
• 4.2.3 色素基因与彩色棉的改良
• 4.2.4 角蛋白基因与棉花纤维的强度
• 4.2.5 其他基因与棉纤维品质的改良
• 5 内切-1,4-β-葡聚糖酶
• 5.1 概述
• 5.2 EGases在植物纤维素生物合成中的作用
• 5.2.1 研究进展
• 5.2.2 存在的问题
• 6 本研究的目的、意义
• 第二部分 研究报告
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 细菌培养基
• 1.1.4 组织培养培养基
• 1.1.5 试剂和溶液
• 1.1.6 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 本研究的技术路线
• 1.2.2 植物表达载体的农杆菌转化
• 1.2.2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）
• 1.2.2.2 农杆菌感受态的制备及转化
• 1.2.2.3 农杆菌质粒的提取
• 1.2.2.4 农杆菌转化子的PCR检测
• 1.2.3 农杆菌介导的棉花遗传转化
• 1.2.3.1 受体外植体的准备
• 1.2.3.2 外植体对潮霉素敏感性的试验
• 1.2.3.3 用于转化的携带质粒的农杆菌的准备
• 1.2.3.4 基因转化
• 1.2.3.5 最佳外植体的确定
• 3对愈伤的诱导和增殖作用'>1.2.3.6 KNO₃对愈伤的诱导和增殖作用
• 1.2.3.7 抗性愈伤剥离外植体以及转分化培养基最佳时间的确定
• 1.2.3.8 诱导愈伤组织和继代培养
• 1.2.3.9 GUS检测
• 1.2.3.10 再生苗的嫁接和移栽
• 1.2.4 转化植株的分子检测
• 1.2.4.1 再生植株的PCR检测
• 1.2.4.2 Southern杂交分析
• 0代植株和纤维的表现'>1.2.5 转RNAi基因T₀代植株和纤维的表现
• 0代植株观察与比较'>1.2.5.1 转RNAi基因T₀代植株观察与比较
• 0代纤维长度的测量与比较'>1.2.5.2 转RNAi基因T₀代纤维长度的测量与比较
• 2 结果与分析
• 2.1 植物表达载体的农杆菌转化
• 2.2 农杆菌介导的棉花遗传转化
• 2.2.1 外植体对潮霉素的敏感性
• 2.2.2 最佳外植体的确定
• 3的作用'>2.2.3 KNO₃的作用
• 2.2.4 抗性愈伤剥离外植体以及转分化培养基最佳时间的确定
• 2.2.5 胚性愈伤的诱导
• 2.2.6 转RNAl干涉基因愈伤及组织的CUS检测
• 2.2.7 再生植株的获得
• 2.2.8 阳性植株的嫁接和移栽
• 2.3 转基因植株的分子检测
• 2.3.1 PCR技术对再生植株的初步分析
• 2.3.1.1 用Hpt引物对再生植株的PCR
• 2.3.1.2 启动子-基因特异引物对再生植株的PCR
• 2.3.2 分化愈伤系的阳性率
• 2.3.3 Hpt引物和启动子-基因特异引物扩增的阳性率比较
• 2.3.4 Southern杂交分析
• 0代植株和纤维的表现'>2.4 转RNAi基因T₀代植株和纤维的表现
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌介导的棉花遗传转化
• 3.1.1 受体的选择
• 3.1.2 Hpt标记基因的使用
• 3和NH₄NO₃在棉花再生中的作用'>3.1.3 KNO₃和NH₄NO₃在棉花再生中的作用
• 3.1.4 GUS在棉花遗传转化中的应用
• 3.1.5 再生苗的嫁接和移栽
• 3.2 转基因植株的分子检测
• 3.2.1 PCR检测的可行性
• 3.2.2 PCR检测的假阳性现象及对策
• 3.2.2.1 污染原因
• 3.2.2.2 减少假阳性现象的对策
• 3.3 下一步工作设想
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介