邻苯二甲醛（OPA）灭活MS2噬菌体效果及机理的初步研究

论文摘要

目的：为MS2噬菌体替代脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株（PV-Ⅰ）做肠道病毒的指示病毒用于消毒效果评价提供进一步理论和实验室证据，实验观察新型消毒剂邻苯二甲醛（OPA）对MS2噬菌体的灭活作用及灭活机理。方法：本文分为两个部分，分述如下：第一部分MS2噬菌体对邻苯二甲醛（OPA）的抵抗力及其部分生物学特性的初步研究，包括：1、MS2噬菌体遗传稳定性研究：对MS2噬菌体进行连续传代培养20代，试验观察0代、5代、10代、15代、20代噬菌体对消毒剂OPA的抵抗力是否有差异。2、MS2噬菌体最佳保存方法研究：在10％甘油、PBS保存介质中，4℃、22℃、-20℃、-70℃保存150天，双层琼脂法测定噬菌体效价，对存活力进行分析比较。3、MS2噬菌体在不同水体中存活力：用加标的方法观察MS2噬菌体在医院污水、自来水、超纯水、湖水、生活污水、工业污水、海水中的消亡情况。4、MS2噬菌体对OPA的抵抗力研究：参照我国卫生部《消毒技术规范》（2002年版）悬液定量杀灭试验观察消毒剂OPA对MS2噬菌体的灭活作用。第二部分邻苯二甲醛（OPA）对MS2噬菌体灭活机理的初步研究，包括：1、邻苯二甲醛对MS2噬菌体结构蛋白的影响：选用1％磷钨酸负染透射电镜技术和血清中和试验来观察消毒剂OPA作用后对MS2噬菌体结构、吸附性及抗原性的影响。2、邻苯二甲醛对MS2噬菌体核酸的影响：使用prime premier 5．0软件，以GenBank NC001417（MS2全基因序列）为模板设计引物，设计了RNA特异性反转录下游引物和针对四种基因的特异性引物，提取噬菌体RNA，通过RT-PCR，对扩增产物进行分析判断，观察消毒剂OPA作用后对MS2噬菌体四个基因的影响。结果：第一部分MS2噬菌体对邻苯二甲醛（OPA）的抵抗力及其部分生物学特性的初步研究：1、MS2噬菌体遗传稳定性研究：相同作用条件下，0、5、10、15、20代之间的灭活对数值差异无统计学意义。即在相同作用条件下各代MS2噬菌体对消毒剂OPA的抵抗力没有差异。MS2噬菌体经过20代传代，对消毒剂OPA抵抗力方面的遗传稳定性保持较好。2、MS2噬菌体最佳保存方法研究：用10％甘油、PBS保存介质中，4℃、22℃、-20℃、-70℃保存150天，MS2噬菌体没有数量级上的变化，消亡对数值均小于1，无明显差异。在不同保存液中，包括10％甘油、PBS、超纯水和营养肉汤中，MS2噬菌体均保持很好的稳定性。相同介质保存，4℃条件比其它温度较优，室温、-20℃、-70℃保存效果相似。4℃保存不需要特殊仪器，且条件最简单，操作最方便，是噬菌体保存的好方法。3、MS2噬菌体在不同水体中存活力：从生活污水、工业污水、海水中分离到了能侵袭埃希氏大肠杆菌ATCC15597的噬菌体，噬菌体噬斑大小形态不一。加标噬菌体在各种水体中，室温条件下比4℃条件下噬菌体消亡更快。在相同保存温度下（4℃和室温），加标MS2噬菌体在超纯水和自来水中稳定性较其它水体好。4、MS2噬菌体对OPA的抵抗力研究：用1500mg／L、2000mg／L、2500mg／L的OPA与MS2噬菌体分别作用3min、2min、1min达到消毒水平；消毒剂OPA对MS2噬菌体的灭活作用中时间因素所起的作用大于浓度因素，表现出快速高效的杀灭特征。第二部分邻苯二甲醛（OPA）对MS2噬菌体灭活机理的初步研究：1、OPA对MS2噬菌体结构蛋白的影响：电镜下很容易观察到MS2噬菌体、它的宿主菌及它们的吸附现象。500mg／L和5000mg／L的OPA与MS2噬菌体分别作用3min、0．5min后，MS2噬菌体颗粒基本被破坏掉，与宿主菌的吸附能力也基本丧失。即提示低浓度和高浓度消毒剂OPA对MS2噬菌体灭活后A蛋白被破坏。500mg／L、1000mg／L、5000mg／L的OPA与MS2噬菌体分别作用3min、0．5min、0．5min，再将抗血清与活的MS2噬菌体作用，MS2噬菌体的存活率降低，表明三个浓度水平的消毒剂OPA灭活的MS2噬菌体的抗原性被破坏。即提示三个浓度水平的消毒剂OPA灭活的MS2噬菌体的外壳蛋白破坏。2、OPA对MS2噬菌体核酸的影响：消毒剂OPA作用以后，MS2噬菌体的四个基因均未扩增出，500mg／L消毒剂OPA作用MS2噬菌体3min和5000mg／L作用0．5min后，MS2噬菌体四个基因（A蛋白基因、衣壳蛋白基因、裂解蛋白基因和复制酶蛋白基因）均被破坏。结论：MS2噬菌体对OPA抵抗性方面的遗传稳定性保持较好；4℃保存是噬菌体保存的好方法；MS2噬菌体在超纯水和自来水中稳定性较其它水体好；OPA对MS2噬菌体表现出快速高效的杀灭特征。OPA灭活MS2噬菌体后，其四个基因（A蛋白基因、衣壳蛋白基因、裂解蛋白基因和复制酶蛋白基因）均被破坏，MS2噬菌体颗粒基本被破坏掉，与宿主菌的吸附能力也基本丧失，抗原性也消失了。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 MS2噬菌体对邻苯二甲醛（OPA）的抵抗力及其部分生物学特性的初步研究
• 一、MS2噬菌体遗传稳定性的研究
• 实验 OPA与不同代数MS2噬菌体作用的实验观察
• 二、MS2噬菌体最佳保存方法的研究
• 实验 MS2噬菌体在不同保存介质中存活力的实验观察
• 三、MS2噬菌体在水体中存活力的研究
• 实验 MS2噬菌体在不同水体中存活情况的实验观察
• 四、MS2噬菌体对OPA抵抗力的研究
• 实验 OPA对MS2噬菌体灭活效果的实验观察
• 第二部分 邻苯二甲醛（OPA）对MS2噬菌体灭活机理的初步研究
• 一、OPA对MS2噬菌体结构蛋白影响的研究
• 实验一 OPA对MS2噬菌体形态和吸附性影响的电镜观察
• 实验二 OPA对MS2噬菌体抗原性影响的血清学实验研究
• 二、OPA对MS2噬菌体核酸RNA影响的研究
• 实验 分子生物学技术研究OPA对MS2噬菌体基因的影响
• 全文总结
• 综述 醛类消毒剂对病毒的灭活作用和灭活机理的研究状况
• 致谢